[發(fā)明專利]構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610662140.4
• 申請(qǐng)日: 2016-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN106282240B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱傳龍;王坤;李毓雯;李軍;岳明;朱甜甜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 楊文晰;孫忠浩

1.一種構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法，其特征在于，具體步驟如下：

A）選取4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，提取并培養(yǎng)BMSCs；

B）分別以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為上下游引物，以c-met基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因c-met并測(cè)序鑒定；

PCR反應(yīng)體系： 5×PS Buffer 10μl，2.5 mM each的dNTP Mix 4μl，10 μM的上游引物1μl，10 μM的下游引物1μl，10 ng/μL的模板1μl，PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 補(bǔ)足至50μl；

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)熱5min；98℃ 10s，55℃ 10s， 72℃ 90s，共30個(gè)循環(huán)； 4℃ 延伸；

C)利用限制性內(nèi)切酶AgeI酶切慢病毒載體GV358，于37℃反應(yīng)3 h，即獲得慢病毒載體GV358的酶切產(chǎn)物線性化載體DNA；

酶切體系：10×CutSmart Buffer 5μl，1 μg/μL的純化的質(zhì)粒DNA2μl，10 U/μl的限制性內(nèi)切酶AgeI酶1μl，ddH₂O補(bǔ)足至50μl；

D)配制線性化載體DNA和目的基因重組反應(yīng)體系，于37℃反應(yīng) 30 min，獲得慢病毒表達(dá)載體GV358-c-met；

重組反應(yīng)體系： 5×CE II Buffer 2μl，步驟C）獲得濃度為800ng/μL的線性化載體DNA 2.5μl，步驟B）獲得濃度為700ng/μL的目的基因c-met 1μl，Exnase II 1μl，ddH₂O補(bǔ)足至10μl；

E)向離心管中加入GV358-c-met 20μg、 pHelper1.0 15μg、pHelper2.0 10μg，以Invitrogen Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑補(bǔ)足至1ml，室溫下孵育15min；然后滴入細(xì)胞密度為70%～80%的293T細(xì)胞中，于37℃，5% CO₂ 培養(yǎng)6h，然后棄去培養(yǎng)基，加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、含 5% CO₂ 繼續(xù)培養(yǎng) 48-72h；

所述細(xì)胞密度為70%～80%的293T細(xì)胞是這樣獲得的：轉(zhuǎn)染前 24 h，用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，以含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁶ 細(xì)胞/15 ml，接種于直徑為10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37℃、含5% CO₂ 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染；并于轉(zhuǎn)染前2h更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基；

F）收集293T 細(xì)胞上清液，于4℃，4000 g 離心10 min；取上清液以0.45 μm 濾器過濾，再收集濾液于4℃，25000 rpm，離心2h；棄去上清，加入病毒保存液,即獲得c-met基因慢病毒；

G)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs接種于96孔板中，每孔加入4～5×10⁴個(gè)細(xì)胞及100μl含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，向各孔中加入10μl步驟F）獲得病毒滴度為2×10⁸ TU/ml的c-met基因慢病毒、10μl終濃度為5μg/ml的ploybrene增強(qiáng)液和80μl的含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5% CO₂ 培養(yǎng)；

感染12h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μl含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基；感染72h后，再次以含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基換液，并向每孔加入終濃度為9μg/ml的嘌呤毒素；待顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光陽性率達(dá)100%后，將藥物篩選濃度維持在1.8μg/ml，即獲得穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株；

其中，所述含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基配制方法為：以質(zhì)量百分比計(jì)，將89%的DMEM培養(yǎng)基、10%的胎牛血清及1%的青霉素-鏈霉素溶液混合后獲得。