[發明專利]一種循環腫瘤DNA肝癌驅動基因高通量檢測方法

在審

• 申請號: 201610661868.5
• 申請日: 2016-08-12
• 公開（公告）號: CN107723352A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請（專利權）人: 嘉興允英醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種基因突變檢測方法，尤其涉及循環腫瘤DNA肝癌驅動基因高通量檢測方法。

背景技術

肝細胞癌為第五大最常見的癌癥，全球癌癥相關死亡率排第三。中國是肝癌大國，2012年全國腫瘤統計顯示中國男性肝癌發病率為293,318人，女性肝癌發病率為101,452人，男女共有394770人發病，占到全球新發肝癌患者的52.7%，名副其實的全球第一。預計在2016年，中國男性肝癌發病率為326,698，女性肝癌發病率為111,017，兩者相加437,715人，相當于中國一個縣的人口，防癌與治療形式十分嚴峻。如何篩選有效的腫瘤分級分子標記物并根據分子標記物進行針對性的治療是目前迫切關注的問題。

在亞洲，包括中國、韓國等，由于地方性乙型肝炎病毒感染等原因肝癌發生率很高。目前已知的肝癌發生分子機制中，高頻突變主要在維護端粒長度的信號通路上，主要是TERT啟動區突變（59%）和HBV插入TERT啟動區突變引起（20%）；其次是Wnt/β-catenin信號通路，主要是CTNNB1（10-32%）和AXIN1（15%）突變引起；其它還有細胞周期控制途徑、表觀遺傳修飾通路、AKT/mTOR和Ras/raf/MAP激酶信號通路、氧化脅迫通路、JAK/STAT通路等；相應發生突變的基因有TP53、CDKN2A、ATM、IRF2、MLL、FGF19、PIK3CA和JAK1等。最近，有研究表明，在59%的肝癌患者以及25%的肝硬化癌前病變患者中TERT啟動子區域都發生了突變。 這些結果預示著TERT可能是一個很好的預后指標。端粒酶逆轉錄酶（TERT）編碼催化端粒酶逆轉錄活性的一個亞基，目的是保持端粒的長度。TERT活性的增加是腫瘤發生的一個標志，TERT的轉錄調控是其癌癥發生激活的主要原因。TERT啟動子區域是其表達調控最重要的區域，這里結合了許多的調控因子，能夠直接激活或者抑制TERT的表達。在膀胱癌的研究中，TERT啟動子區域的突變使得患者預后不好，生存期縮短，復發幾率遠大于TERT啟動子區域野生型患者。TERT啟動子區域的突變與BRAF突變經常共同存在于乳頭狀甲狀腺癌中，這部分患者預后與TERT啟動子區域野生型患者也有很大的差異。TERT啟動子區域野生型的肝癌患者的預后要好于突變型患者。由于TERT啟動子區域突變在肝癌中頻發并與腫瘤的發生密切相關。此外， CTNNB1、AXIN1、TP53、CDKN2A、ATM、IRF2、FGF19、PIK3CA和JAK1等基因的突變與肝癌的發生都有顯著的相關性。這些基因突變在中國人群中的分布和預后的相關性方面都亟待研究。因此，研究這些基因突變與肝癌預后及復發的關系是一個重要的課題。

當前，癌癥基因檢測主要以組織樣本為主。基于腫瘤組織樣本的檢測，存在兩個問題：一、腫瘤組織大都來源于活檢技術即穿刺和活檢鉗活檢，這樣會給病人帶來極大的痛苦，是有創檢測；二、對于某些晚期的病人，不能穿刺或者手術，病人樣本就很難獲取，因此就很難根據檢測的結果對病人進行靶向用藥。而且，采用靶向治療的患者，都已經處于中晚期，身體狀況較差。因此，盡量減少檢測對身體的創傷具有非常重要意義。另一方面，隨著精準治療的不斷發展，越來越多靶向治療可供選擇；同時也存在越來越多的靶向位點需要檢測。因此，會產生一個問題，更多的治療選擇需要從患者身上獲得更多的樣品。基于上述發展過程中產生的矛盾，臨床上迫切需要一種能夠替代目前市場上需要較多樣本的基因檢測方法。近年來研究發現腫瘤患者外周血存在腫瘤循環DNA(ctDNA)；而且越來越多的臨床研究表明是非常好的組織樣本的代替品。本專利采用血漿作為檢測樣本，有如下優勢：1、提供腫瘤實時信息---當前腫瘤的突變狀態；2、非侵入性液體活檢---減少患者的成本和風險；3、沒有腫瘤組織可用---仍然可以方便進行檢測；4、消除組織樣本偏差---評估全身腫瘤的整體狀態。

因此，個體化精準治療，能提高晚期肺癌患者的生存質量和生存時間。但是需要對靶標位點進行精準檢測。而利用血漿樣本，結合第二代高通量測序技術，可以更全面的檢測肺癌的基因突變信息，從而獲得更好的治療方案，提高預后效果。

發明內容

本發明提供一種準確度高、臨床意義明確的肝癌驅動基因高通量檢測方法。

實現本發明目的的一種肝癌驅動基因高通量檢測方法，包括如下步驟:

(1)根據人類基因組HG19，調取肝癌高頻突變基因的外顯子序列。常見肝癌基因列表如下：

調取外顯子的序列包含列表基因的基因區域，以及己知各個轉錄本的啟動子區域;