[發(fā)明專利]一種循環(huán)腫瘤DNA肝癌驅(qū)動(dòng)基因高通量檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610661868.5
• 申請(qǐng)日: 2016-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107723352A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嘉興允英醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種用于循環(huán)腫瘤DNA肝癌驅(qū)動(dòng)基因高通量檢測(cè)方法，包括肝癌高頻突變基因掃描試劑盒的方法和試劑盒的篩查方法。

2.肝癌高頻突變基因掃描試劑盒的方法包括如下步驟：

(1)根據(jù)人類基因組HG19，調(diào)取肺癌高頻突變基因的外顯子序列和內(nèi)含子序列；

常見(jiàn)肝癌基因列表如下：

TP53CTNNB1AXIN1ALBARID2ARID1AACVR2ANFE2L2RPS6KA3KEAP1CDKN2ACDKN1ARB1TSC2HNF1AZNRF3PTENTSC1HGFAPOBATMSETD2SMARCA2JAK3TERTDAPK1CHD7CREBBPCCND1CDKN2BFGF19FGF3FGF4PIK3CAKRASNRASHRASEGFRMETERBB2BRAFKDRPDGFRBKITFLT3AXIN2MYCJAK1JAK2STAT3IGF1RIGF2RAPCAKT1PDGFRAVEGFAIRF2CCNE1MTORFGFR1FGFR2FGFR3FGFR4ARID1BPBRM1TCF7L2EP300ATRTTNFGF5UBE3CFLT1KMT2BKMT2CKMT2DEGFRBRAFDDR2MEKPDGFRAALKRETNTRK1PIK3CATP53ROS1KRASFGFR3PTENMETNRASRICTORFGFR1HER2HRASAKT1BIM

調(diào)取的序列包含列表基因的基因區(qū)域，以及己知各個(gè)轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域;

(2)對(duì)每個(gè)區(qū)域中非重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)120bp的探針序列，每個(gè)序列沿著基因位置挪動(dòng)設(shè)計(jì)，探針之間的挪動(dòng)大小60bp;

(3)采用原位合成技術(shù)，在芯片上大量合成設(shè)計(jì)的探針，并利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和轉(zhuǎn)錄的方法擴(kuò)增出大量的帶有生物素標(biāo)記的探針，并制作肝癌基因掃描試劑盒;

所述試劑盒篩查方法包括如下步驟:

從病人血液中提取100-300ng cfDNA (Cell Free DNA)，然后利用肝癌常見(jiàn)基因探針將目的基因序列捕獲出來(lái)，再用測(cè)序儀(Illumina Nextseq 500)進(jìn)行高通量測(cè)序，進(jìn)而分析，找出與肝癌相關(guān)基因的所有突變信息，從而得到患者肝癌的變異情況，以達(dá)到準(zhǔn)確基因診斷的目的。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌高頻突變基因的篩查方法，其特征在于：采用測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序，分析的過(guò)程包括單核昔酸多態(tài)性分析過(guò)程、所述括入缺失標(biāo)記分析流程、大片段擴(kuò)增確實(shí)分析流程和基因融合分析流程;

所述單核昔酸多態(tài)性分析過(guò)程包括如下步驟:

(1)測(cè)序儀獲取原始短序列;

(2)去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù);

(3)把短序列定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上;

(4)統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果信息，短序列數(shù)量、目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小、平均測(cè)序深度等;

(5)過(guò)濾低質(zhì)量值和低覆蓋度的單核昔酸;

(6)利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP信息對(duì)單核昔酸進(jìn)行注釋，確定突變位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、氨基酸改變、單核昔酸功能、SIFT預(yù)測(cè)單核昔酸影響蛋白功能預(yù)測(cè);

(7)根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的單核昔酸作為候選的單核昔酸，在候選的單核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測(cè)序項(xiàng)目中出現(xiàn)的單核昔酸；同時(shí)，過(guò)濾掉SIFT預(yù)測(cè)對(duì)蛋白功能無(wú)影響的

單核昔酸作為最后疾病相關(guān)的候選單核昔酸;

所述括入缺失標(biāo)記分析過(guò)程包括如下步驟

(1)把去除接頭序列和低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類基因組上;

(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;

(3)利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP信息對(duì)InDel進(jìn)行注釋，確定突變位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、編碼區(qū)域序列的改變、對(duì)氨基酸的影響、InDel功能;

(4)根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的InDel作為候選的InDels，在候選的InDels中去除掉在dbSNP、其他外顯子測(cè)序項(xiàng)目中出現(xiàn)的InDel，最后篩選出疾病相關(guān)的候選InDels;

所述大片段擴(kuò)增確實(shí)分析流程包括如下步驟:

(1)測(cè)序儀獲取原始短序列;

(2)去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù);

(3)把短序列定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上;

(4)統(tǒng)計(jì)目標(biāo)區(qū)域覆蓋大小，然后根據(jù)每個(gè)目標(biāo)區(qū)域位點(diǎn)的位置信息為橫坐標(biāo)，每個(gè)位置相應(yīng)的覆蓋度為縱坐標(biāo)作圖，得出擴(kuò)增和缺失的分析圖;

所述括入缺失標(biāo)記分析過(guò)程包括如下步驟

(1)把去除接頭序列和低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類基因組上;

(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;

(3)利用CCDS、人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP信息對(duì)InDel進(jìn)行注釋，確定突變位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、編碼區(qū)域序列的改變、對(duì)氨基酸的影響、InDel功能;

(4)根據(jù)疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的基因融合作為候選的融合基因，在候選的融合基因中去除掉在dbSNP、其他外顯子測(cè)序項(xiàng)目中出現(xiàn)的融合基因，最后篩選出疾病相關(guān)的候選融合基因；

所述基因融合分析流程包括如下步.:

(1)測(cè)序儀(Illumina Nextseq 550)獲取原始短序列;

(2)用Trim Galore進(jìn)行QC并去除低質(zhì)量數(shù)據(jù);

(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)軟件定位到人類基因組數(shù)據(jù)相應(yīng)的位置上(所用到參數(shù): bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);

(4)用factera檢測(cè)多個(gè)基因基因的全部或一部分的編碼區(qū)首尾相連，包括染色體易位、中間缺失或染色體倒置所致的結(jié)果，得到基因融合結(jié)果。