[發明專利]一種遺傳性乳腺癌突變基因高通量篩查方法

在審

• 申請號: 201610660617.5
• 申請日: 2016-08-12
• 公開（公告）號: CN107723350A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請（專利權）人: 嘉興允英醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種遺傳性乳腺癌突變基因高通量篩查方法，包括制作遺傳性乳腺癌突變基因掃描試劑盒的方法和試劑盒篩查方法，遺傳性乳腺癌突變基因突變試劑盒的方法包括如下步驟：

(1)根據人類基因組HG19，調取遺傳性乳腺癌突變基因的外顯子序列。

2.常見遺傳性乳腺癌突變基因列表如下：

調取外顯子的序列包含列表基因的基因區域，以及己知各個轉錄本的啟動子區域;

(2)對每個區域中非重復區域設計120bp的探針序列，每個序列沿著基因位置挪動設計，探針之間的挪動大小60bp;

(3)采用原位合成技術，在芯片上大量合成設計的探針，并利用多聚酶鏈式反應或轉錄的方法擴增出大量的帶有生物素標記的探針，并制作遺傳性乳腺癌突變基因掃描試劑盒;

所述試劑盒篩查方法包括如下步驟:

從正常人血液中提取基因組DNA，然后利用遺傳性乳腺癌突變基因探針將目的基因序列捕獲出來，再用測序儀(Illumina Nextseq 500)進行高通量測序，進而分析，找出遺傳性乳腺癌突變基因的所有突變信息，以達到遺傳性乳腺癌突變基因篩查的目的。

3.根據權利要求1所述的一種遺傳性乳腺癌突變基因的篩查方法，其特征在于：分析樣本采用血液中基因組DNA，采用測序儀進行高通量測序，分析的過程包括單核昔酸多態性分析過程、所述括入缺失標記分析流程和大片段擴增確實分析流程;

所述單核昔酸多態性分析過程包括如下步驟:

(1)測序儀獲取原始短序列;

(2)去除測序數據中的接頭和低質量數據;

(3)把短序列定位到人類基因組數據相應的位置上;

(4)統計測序結果信息，短序列數量、目標區域覆蓋大小、平均測序深度等;

(5)過濾低質量值和低覆蓋度的單核昔酸;

(6)利用CCDS、人類基因組數據庫、dbSNP信息對單核昔酸進行注釋，確定突變位點發生的基因、坐標、mRNA位點、氨基酸改變、單核昔酸功能、SIFT預測單核昔酸影響蛋白功能預測;

(7)根據疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的單核昔酸作為候選的單核昔酸，在候選的單核昔酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人類基因組、其他外顯子測序項目中出現的單核昔酸，同時，過濾掉SIFT預測對蛋白功能無影響的

單核昔酸作為最后疾病相關的候選單核昔酸;

所述括入缺失標記分析過程包括如下步驟

(1)把去除接頭序列和低質量的測序數據比對到人類基因組上;

(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;

(3)利用CCDS、人類基因組數據庫、dbSNP信息對InDel進行注釋，確定突變位點發生的基因、坐標、mRNA位點、編碼區域序列的改變、對氨基酸的影響、InDel功能;

(4)根據疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的InDel作為候選的InDels，在候選的InDels中去除掉在dbSNP、其他外顯子測序項目中出現的InDel，最后篩選出疾病相關的候選InDels;

所述大片段擴增確實分析流程包括如下步驟:

(1)測序儀獲取原始短序列;

(2)去除測序數據中的接頭和低質量數據;

(3)把短序列定位到人類基因組數據相應的位置上;

(4)統計目標區域覆蓋大小，然后根據每個目標區域位點的位置信息為橫坐標，每個位置相應的覆蓋度為縱坐標作圖，得出擴增和缺失的分析圖，所述括入缺失標記分析過程包括如下步驟：

(1)把去除接頭序列和低質量的測序數據比對到人類基因組上;

(2)找出序列中所含有的括入/缺失的信息;

(3)利用CCDS、人類基因組數據庫、dbSNP信息對InDel進行注釋，確定突變位點發生的基因、坐標、mRNA位點、編碼區域序列的改變、對氨基酸的影響、InDel功能;

(4)根據疾病樣品和正常樣品信息，選出疾病樣品所共有的而在正常組中不存在的基因融合作為候選的融合基因，在候選的融合基因中去除掉在dbSNP、其他外顯子測序項目中出現的融合基因，最后篩選出疾病相關的候選融合基因，所述基因融合分析流程包括如下步.:

(1)測序儀(Illumina Nextseq 550)獲取原始短序列;

(2)用Trim Galore進行QC并去除低質量數據;

(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)軟件定位到人類基因組數據相應的位置上(所用到參數: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);

(4)用factera檢測多個基因基因的全部或一部分的編碼區首尾相連，包括染色體易位、中間缺失或染色體倒置所致的結果，得到基因融合結果。