[發明專利]一種分枝桿菌分型的高通量測序方法

在審

• 申請號: 201610660394.2
• 申請日: 2016-08-12
• 公開（公告）號: CN107723349A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請（專利權）人: 嘉興允英醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/32
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技術領域

本發明涉及一種分枝桿菌分型的高通量測序方法。

背景技術

分枝桿菌是人類歷史上最重要的病原微生物群之一。分枝桿菌屬的250多種菌種中，結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和非洲分枝桿菌等因生物學特性接近又稱為結核分枝桿菌復合群。分枝桿菌屬中除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌（臨床上已少見）以外的分枝桿菌統稱為非結核分枝桿菌，例如鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌等。

人結核病的主要病原菌是結核分枝桿菌、牛分枝桿菌等結核分枝桿菌復合群的菌株。結核分枝桿菌是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見。結核病至今仍為重要的傳染病。據WHO報道，每年約有800萬新病例發生，至少有300萬人死于該病。結核分枝桿菌是典型的胞內致病菌，通過進化獲得一系列毒力成分，又通過多種機制抑制宿主免疫應答，逃逸免疫監視，導致結核病的發生。但結核病確切的發病機制尚不清楚，這給結核病的有效防治造成了極大困難。隨著預防接種、抗結核藥物的不斷發展和衛生生活狀況的改善，結核的發病率和死亡率曾一度大幅下降。但是，近年來世界各地結核分枝桿菌的多耐菌株逐漸增多，甚至引起暴發流行，發病率又有上升趨勢。因此，結核病又成為了威脅人類健康的全球性衛生問題。非結核分枝桿菌(Nontuberculosis mycobacteria，NTM)特性有別于結核分枝桿菌，如對酸、堿比較敏感;對常用的抗結核菌藥物較耐受;生長溫度不如結核分枝桿菌嚴格;它是一種環境分枝桿菌，主要存在于自然環境中，但可以通過動物或醫療器械消毒滅菌不徹底而傳染給人。它在自然界如空氣、水和土壤中廣泛存在，一般不致病。自20世紀80年代以來，隨著艾滋病感染者人數的增加，播散性NTM感染以及以往認為非致病的分枝桿菌引起人類疾病的報道不斷增多，有報道NTM的耐藥率為95.9%；耐多藥率為83.7%。1999年上海第一肺科醫院報道，15年間5592例痰抗酸桿菌陽性患者中經鑒定為非結核分枝桿菌者173例中有咳嗽癥狀者占78%，咯血者58%，發熱者26%，有空洞者40%。表明有一定致病性。非結核分枝桿菌從結核樣病人分離的陽性率，我國為3%～15%。然后，隨著結核病的回潮，非結核分枝桿菌感染率急速上升。我國現有結核病患者700萬，據2010年第五次全國結核病流行病學調查，其中非結核分枝桿菌的感染率為22.9％，對人類致病的NTM有20余種。近年來，NTM病呈快速增多趨勢，并己成為威脅人類健康的重要公共衛生問題。結核桿菌感染引起的肺結核病和非結核分枝桿菌（NTM）肺病二者在臨床特點極其相似，臨床上極易將NTM肺病誤診或漏診為肺結核病，不同菌種感染引起的疾病治療方案是截然不同的，尤其是不同的NTM引起的NTM病，在化療方案的選擇和用藥時間都各不相同。有研究認為62％抗結核治療效果不佳的肺結核為NTM感染，也就是說臨床上誤將NTM肺病當肺結核病治療導致治療效果不佳的現象比較常見。因此，2012年我國專家在診斷和治療分枝桿菌病達成了一個共識，要求在診斷和治療前進行分枝桿菌菌種鑒定，鑒定出是結核分枝復合群感染還是非結核分枝桿菌感染、以及是何種非結核分枝桿菌感染，以便能對不同分枝桿菌感染進行對癥治療。所以，在分枝桿菌感染、預防和治療中，及時、準確地鑒定分枝桿菌對保護人類健康具有重要意義。

臨床上對結核和非結核分枝桿菌肺病很難作出鑒別診斷，只能從標本中分離出分枝桿菌作菌種鑒定，才能確診。分枝桿菌屬的表型鑒定一直沿用以生化實驗為核心的傳統鑒定方法，傳統的分枝桿菌菌種鑒定缺點是耗時長，步驟繁瑣，污染大，價格高，缺乏可重復性，欠缺數值分類，需要有經驗的專家而且可能產生模棱兩可的結果。近年來，隨著分子生物學診斷技術的不斷進步，分枝桿菌菌種鑒定方法得到了很快的發展。常用的方法有PCR-RFLP、PCR-直接測序法和DNA probe等，這些方法各有優缺點，仍然不能滿足臨床的需要，因此，急需建立快速、簡便、準確的分枝桿菌菌種鑒定方法。

利用分枝桿菌已有數據庫，在第二代高通量測序技術幫助下，可以更好、更快速、更準確的為鑒定分枝桿菌提供更全面的信息。本專利利用二代高通量測序技術檢測分枝桿菌桿菌基因序列，有如下優勢：縮短了對分枝桿菌鑒定所需時間，可以一次檢測全部分枝桿菌基因，獲取分枝桿菌基因全部的信息，可以更全面的鑒定分枝桿菌的信息，有助于醫生更準確制定治療方案，減少患者的痛苦。

因此，利用二代高通量測序技術鑒定分枝桿菌的菌種，可以為醫生提供患者所感染分枝桿菌的菌種信息，有助于醫生更準確制定治療方案，減少疾病的治療療程、成本和不良反應的發生。

發明內容