[發明專利]一種分枝桿菌分型的高通量測序方法

在審

• 申請號: 201610660394.2
• 申請日: 2016-08-12
• 公開（公告）號: CN107723349A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 張道允;鞏子英;葉建偉;王偉
• 申請（專利權）人: 嘉興允英醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于分枝桿菌分型的檢測方法，包括分枝桿菌菌種基因捕獲試劑盒的方法。

2.實現本發明目的一種分枝桿菌菌種分型鑒定檢測方法，包括如下步驟:

(1)根據分枝桿菌菌種，調取不同分枝桿菌基因組序列；

常見分枝桿菌菌種如下：

結核桿菌復合群：Mycobacterium africanum，Mycobacterium bovis，Mycobacterium microti，Mycobacterium tuberculosis；

非結核桿菌：Mycobacterium abscessus，Mycobacterium aurum，Mycobacterium avium，Mycobacterium bohemicum，Mycobacterium brumae，Mycobacterium chelonae，Mycobacterium chubuense，Mycobacterium fortuitum，Mycobacterium gastri，Mycobacterium genavense，Mycobacterium gordonae，Mycobacterium haemophilum，Mycobacterium interjectum，Mycobacterium intracellulare，Mycobacterium kansasii，Mycobacterium lentiflavum，Mycobacterium leprae，Mycobacterium mageritense，Mycobacterium marinum，Mycobacterium mucogenicum，Mycobacterium neoaurum，Mycobacterium nonchromogenicum，Mycobacterium peregrinum，Mycobacterium phlei，Mycobacterium scrofulaceum，Mycobacterium simiae，Mycobacterium smegmatis，Mycobacterium szulgai，Mycobacterium thermoresistibile，Mycobacterium triplex，Mycobacterium ulcerans，Mycobacterium vaccae，Mycobacterium xenopi.

調取分枝桿菌屬種序列包含列表不同分枝桿菌的基因組；

(2)對每個菌種選取總長度為3kb的非重復區域，設計120bp的探針序列，每個序列沿著基因位置挪動設計，探針之間的挪動大小60bp;

(3)采用原位合成技術，在芯片上大量合成設計的探針，并利用多聚酶鏈式反應和轉錄的方法擴增出大量的帶有生物素標記的探針，并制作分枝桿菌捕獲試劑盒；

所述試劑盒檢測方法包括如下步驟:

從樣本中提取基因組DNA，然后利用全部的結核桿菌基因探針將目的基因序列捕獲出來，再用測序儀(Illumina Nextseq 500)進行高通量測序，進而分析，找出分枝桿菌的DNA信息，通過基因組序列信息的差異和比對，區分不同分支桿菌屬下的菌種，以達到準確診斷的目的。

3.利用測序儀(Illumina Nextseq 500)進行高通量測序進行分型分析流程包括如下步驟:

(1)測序儀(Illumina Nextseq 500)獲取原始短序列并去除測序數據中的接頭;

(2)用Trim Galore進行QC并去除低質量數據;

(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)軟件定位到每種分歧桿菌基因組數據（例如NC_010397.1_GCF_000069185.1_ASM6918v1_genomic Mycobacterium abscessus chromosome）相應的位置上(所用到參數: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);

(4) 使用PicardTools及自寫腳本，針對不同樣本不同類型的分歧桿菌基因進行歸一化處理，統計相應的覆蓋度及短序列數量，得到分型結果。