[發(fā)明專利]腫瘤標(biāo)志物的組合檢測方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610656938.8
• 申請日: 2016-08-11
• 公開（公告）號: CN107723363A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王建銘;韓曉亮;徐海;馬竣;宋樂樂;周光朋
• 申請（專利權(quán)）人: 博爾誠（北京）科技有限公司;博誠研究中心
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;G01N33/72;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11280
• 代理人: 李渤

1.一種腫瘤標(biāo)志物的組合檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括：

1)提供來自檢查對象的樣本，優(yōu)選地，所述檢查對象為人；

2)對步驟1)所述的樣本進(jìn)行檢測，所述檢測為測定Septin9基因是否存在甲基化以及測定蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物是否存在；

其中，所述樣本選自細(xì)胞系、組織學(xué)切片、組織活檢/石蠟包埋的組織、體液、糞便、結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細(xì)胞；從血液中分離的細(xì)胞、體液、痰液、咽拭子，或其組合；優(yōu)選地選自結(jié)腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細(xì)胞、由血液中分離的細(xì)胞中的一種或多種；

所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物選自腦癌、胃癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、甲狀腺癌、淋巴癌、膀胱癌、白血病、腎癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌或子宮癌的蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物中的一種或多種。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述Septin9基因甲基化的測定是通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)現(xiàn)的。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)定量PCR中的上游引物序列為SEQ ID NO:1；下游引物序列為SEQ ID NO:2；阻斷劑序列為SEQ ID NO:3；探針序列為SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量PCR以ACTB為內(nèi)對照基因；更優(yōu)選地，所述ACTB的上游引物序列為SEQ ID NO:6；下游引物序列為SEQ ID NO:7；探針序列為SEQ ID NO:8；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋弘A段1：一個(gè)循環(huán)94℃，20分鐘；階段2：45個(gè)循環(huán)，62℃，5秒，55.5℃，35秒，93℃，30秒；階段3：40℃，5秒。

4.如權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物的測定方法選自液態(tài)芯片、固態(tài)芯片、酶聯(lián)免疫、放射免疫、化學(xué)發(fā)光免疫、質(zhì)譜、高效液相層析、Western印記和序列分析中的一種或多種。

5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物選自CEA、大便中血紅蛋白、MG7、IDH1、CA199、甲胎蛋白(AFP)、CA125、CA72-4、CA242、CA50、Cyfra21-1、PSA、FPSA/TPSA、NSE、SCC、proGRP、PG、PGI/PGII、TPA、TPS、CA153、β-HCG、SF、H3K4me1、H3K4me3、H4K8ac、Auto-ab p53中的一種或多種；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物選自癌胚抗原、大便中血紅蛋白、CA724、甲胎蛋白、CA242、CA199、Cyfra21-1、CA153、CA125、PSA和β-HCG中的一種或多種。

6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原、大便中血紅蛋白、CA724、甲胎蛋白、CA242和CA199。

7.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物為癌胚抗原、大便中血紅蛋白、CA724、甲胎蛋白、CA242、CA199、Cyfra21-1、CA153、CA125、PSA和β-HCG。

8.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括測定輔助核酸腫瘤標(biāo)志物，所述輔助核酸腫瘤標(biāo)志物選自KRAS、BRAF、EGFR、RNF180、SHOX2、PTGER4、FOXL2、GNG4、C1orf70、C9orf50、CTSF、CYP1B1、RNF135、HOXD8、CYBA、SIM1、C7orf51、ARRDC2、GABRG3、RNLS、PAX2、PROC、PITPNM3、HOXXD10、LYPLAL1、hsa-miR-122、hsa-let-7b中的一種或多種；所述輔助核酸腫瘤標(biāo)志物的測定方法包括PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、數(shù)字PCR、液態(tài)芯片、固態(tài)芯片、原位雜交、普通測序和高通量測序中的一種或多種。

9.一種用于如權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)所述的方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用于通過實(shí)時(shí)定量PCR測定Septin9基因甲基化的所需要引物、探針和試劑，以及測定蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物所需要的試劑。

10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物選自癌胚抗原、大便中血紅蛋白、CA724、甲胎蛋白、CA242、CA199、Cyfra21-1、CA153、CA125、PSA和β-HCG中的一種或多種；優(yōu)選地，所述測定蛋白質(zhì)腫瘤標(biāo)志物的所需要的試劑選自液態(tài)芯片、固態(tài)芯片、酶聯(lián)免疫、放射免疫、化學(xué)發(fā)光免疫、質(zhì)譜、高效液相層析、Western印記和序列分析中的一種或多種所需要的試劑；

優(yōu)選地，所述Septin9基因甲基化的測定是通過實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)現(xiàn)的；

更優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量PCR中的上游引物序列為SEQ ID NO:1；下游引物序列為SEQ ID NO:2；阻斷劑序列為SEQ ID NO:3；探針序列為SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量PCR以ACTB為內(nèi)對照基因；更優(yōu)選地，所述ACTB的上游引物序列為SEQ ID NO:6；下游引物序列為SEQ ID NO:7；探針序列為SEQ ID NO:8；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋弘A段1：一個(gè)循環(huán)94℃，20分鐘；階段2：45個(gè)循環(huán)，62℃，5秒，55.5℃，35秒，93℃，30秒；階段3：40℃，5秒。