[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的引物、試劑盒、檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610651209.3
• 申請(qǐng)日: 2016-08-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106282335B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃平;歐陽(yáng)小峰;毛家麗;周宇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙)51220
• 代理人: 馬碧娜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的引物、試劑盒、檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

目前我國(guó)每年新生聾兒2萬(wàn)-3萬(wàn)，其中50％是由遺傳因素造成的。藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致耳聾是新生兒先天性耳聾及成人后天性耳聾的主要原因。

藥物性耳聾被破壞的不是外耳和中耳的聲音傳導(dǎo)系統(tǒng)，即非傳導(dǎo)性耳聾，而是感知聲音最重要又最脆弱的部位耳蝸毛細(xì)胞遭到藥毒損害。毛細(xì)胞是聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)的末梢感受器，正常情況下毛細(xì)胞把聲能轉(zhuǎn)化成生物電沖動(dòng)傳給聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)輸入大腦中樞，人才能聽(tīng)到外界的各種聲音。耳毒性藥物專(zhuān)門(mén)傷害毛細(xì)胞，讓人感受不到外界的聲音。這種耳聾屬于“感音神經(jīng)性耳聾”，是不可逆的。

大劑量的氨基糖苷類(lèi)抗生素具有一定的耳毒性，能導(dǎo)致前庭功能受損，從而使得聽(tīng)力減退，甚至耳聾。然而在氨基糖苷類(lèi)抗生素引發(fā)的耳聾患者中，有些患者對(duì)毒性特別敏感，小劑量甚至單次劑量的藥物就可能導(dǎo)致耳聾，存在個(gè)體差異。一般來(lái)講，這類(lèi)藥物在正常劑量下使用是比較安全的，但是有些病人對(duì)該類(lèi)藥物具有家族遺傳易感性和個(gè)體差異，在使用中即使很小劑量、短療程、正常途徑，也可能出現(xiàn)早期或嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)。藥物性耳聾可以發(fā)生在各年齡，但少兒更易發(fā)生。因此，在使用氨基糖苷類(lèi)抗生素之前對(duì)用藥對(duì)象進(jìn)行藥物敏感性篩選，提高合理用藥，減少濫用聽(tīng)力損害藥物是降低我國(guó)目前少兒聽(tīng)力殘疾的有效途徑。

對(duì)母系遺傳性耳聾大家系研究表明，線粒體脫氧核糖核酸12SrRNA基因A1555G基因突變與家族性致聾有關(guān)，進(jìn)一步的常染色體全基因組掃描研究發(fā)現(xiàn)，45個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)可作為家族系連鎖分析的候選位點(diǎn)，表明除線粒體突變外，核基因組中多個(gè)基因位點(diǎn)可能與耳聾有關(guān)，所以母系遺傳性耳聾是多基因決定的，線粒體突變、陽(yáng)性核基因及不同的環(huán)境因素的影響將導(dǎo)致不同的表型。大量家系研究表明線粒體DNA的MTRNR1基因上的A1555G，U1494A，T1095C，961T缺失位點(diǎn)與藥物性耳聾有密切關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的引物、試劑盒、檢測(cè)方法，可用于檢測(cè)評(píng)估少兒耳聾性遺傳風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的引物，包括檢測(cè)MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三個(gè)SNP位點(diǎn)的特異性引物為：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC和GCATCTTTCCCTTGCGGTAC；檢測(cè)MTNR1基因上的A1555G、U1494A，T1095C三個(gè)SNP位點(diǎn)、DEL961T CINS位點(diǎn)的DNA測(cè)序引物，DNA測(cè)序引物為GCGTTTGGTCCTAGCCTTT。

一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述試劑盒包括PCR反應(yīng)套裝、PCR產(chǎn)物純化套裝、測(cè)序反應(yīng)套裝，所述PCR反應(yīng)套裝由以下組分組成，2.5uL 10X PCR反應(yīng)緩沖液，0.2uL25mM dNTP混合液，25mM MgCl₂溶液1.5ul，0.125ul 5units/ul Taq DNA聚合酶，20uM特異性引物0.25uL，去離子水19.175ul；所述PCR產(chǎn)物純化套裝：1uints/ulSAP酶0.75ul，10uints/ul Exo酶0.375ul，去離子水3.875ul；所述測(cè)序反應(yīng)套裝：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA測(cè)序引物1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去離子水2μl。

一種檢測(cè)少兒耳聾遺傳風(fēng)險(xiǎn)的測(cè)試方法，其特征在于：包括以下步驟，

（1）提取DNA模板

提取口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA；

（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)

反應(yīng)體系總體積為25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5 uL，25mM dNTP混合液0.2 uL，25mM MgCl2溶液1.5 uL，5units/ uL Taq DNA聚合酶0.125 uL，20μM特異性引物各0.25 uL，去離子水19.175 Ul；

PCR反應(yīng)條件為94℃、12分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃、30秒，60 ℃、30秒，72℃、30秒，然后進(jìn)行72℃、10分鐘；

（3）PCR產(chǎn)物純化

反應(yīng)條件為37℃、15分鐘，72℃、20分鐘；

（4）DNA測(cè)序反應(yīng)