[發明專利]一種檢測少兒耳聾遺傳風險的引物、試劑盒、檢測方法

有效

• 申請號: 201610651209.3
• 申請日: 2016-08-10
• 公開（公告）號: CN106282335B
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 黃平;歐陽小峰;毛家麗;周宇
• 申請（專利權）人: 上海金域醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙)51220
• 代理人: 馬碧娜

1.一種檢測少兒耳聾遺傳風險的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括PCR反應套裝、PCR產物純化套裝、測序反應套裝，所述PCR反應套裝由以下組分組成，2.5uL 10X PCR反應緩沖液，0.2uL25mM dNTP混合液，25mM MgCl₂溶液1.5ul，0.125ul 5units/ul Taq DNA聚合酶，20uM特異性引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC和GCATCTTTCCCTTGCGGTAC 0.25uL，去離子水19.175ul；所述PCR產物純化套裝：1uints/ulSAP酶0.75ul，10uints/ul Exo酶0.375ul，去離子水3.875ul；所述測序反應套裝：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA測序引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTT 1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去離子水2μl；

該試劑盒使用方法包括以下步驟，

(1)提取DNA模板

提取口腔上皮細胞的基因組DNA；

(2)PCR擴增反應

反應體系總體積為25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反應緩沖液2.5uL，25mM dNTP混合液0.2uL，25mM MgCl2溶液1.5uL，5units/uL Taq DNA聚合酶0.125uL，20μM特異性引物各0.25uL，去離子水19.175Ul；

PCR反應條件為94℃、12分鐘，進行30個循環的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后進行72℃、10分鐘；

(3)PCR產物純化

反應條件為37℃、15分鐘，72℃、20分鐘；

(4)DNA測序反應

使用DNA測序引物，反應體系為總體積5uL，包含PCR純化產物1uL，25％BigDye mix 1uL，3.2μM DNA測序引物1uL，去離子水2uL，

反應條件為98℃、2分鐘，進行25個循環的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分鐘，

反應結束后加入125mM EDTA溶液1uL和100％乙醇溶液15uL，于室溫下沉淀15分鐘；在4℃以3650轉/分的轉速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650轉/分的轉速離心15分鐘，輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8μl，放入測序儀中。