[發明專利]一種解淀粉芽孢桿菌RH9、篩選方法及用途

在審

• 申請號: 201610651128.3
• 申請日: 2016-08-05
• 公開（公告）號: CN107058146A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 趙君峰;糾敏;原江鋒;符丹丹;李陽
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N15/03;C12P21/02;C12R1/07
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技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌RH9、篩選方法及用途。

背景技術

抗菌肽對食品中的多種革蘭氏陽性及陰性細菌均有較強的殺滅作用，能快速抑制微生物的生長，食用后易被體內蛋白酶水解消化且無毒副作用，在酸性條件下活性很強，具有良好的溶解性和穩定性，是極具發展前景的新型食品防腐劑。

伊枯草菌素A(iturinA)及其同系物也屬于抗菌肽，主要來源于芽孢桿菌屬菌株的次生代謝產物，具有廣譜抗病性和不易產生抗藥性等優點，對植物和動物病原菌具有較高的抑制活性，尤其具有強烈的抗真菌活性。

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種可以分泌iturinA等抗菌肽物質的芽孢桿菌。由于IturinA對絲狀霉菌有良好的抑制作用，不僅可以在農業上用于進行生物防治，而且在工業和環境保護上也有著廣泛的應用潛力。但實際中，其并未在工業以及環境保護中廣泛應用，究其原因，是因為它生產成本巨大，缺乏一種高產iturinA的解淀粉芽孢桿菌。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌RH9在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號為CGMCC 12489，保藏日期為2016年5月23日，該解淀粉芽孢桿菌RH9可以高產iturinA，且生產iturinA的成本較低。

本發明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，包括以下步驟：

步驟1，原始菌株解淀粉芽孢桿菌RH3的活化；

步驟2，初級誘變

步驟2.1，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行青霉素誘變，獲得iturinA產量高的第一正突變株和第二正突變株；

步驟2.2，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行亞硝基胍誘變，獲得iturinA產量高的第三正突變株和第四正突變株；

步驟3，基因組改組

步驟3.1，原生質體制備與再生

利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質體溶液；利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質體溶液；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質體溶液；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質體溶液；

步驟3.2，原生質體融合

步驟3.2.1，將第一正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第一紫外滅活溶液，將第二正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第二紫外滅活溶液，將第三正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第三紫外滅活溶液，將第四正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第四紫外滅活溶液；

步驟3.2.2，將第一正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第一熱滅活溶液，將第二正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第二熱滅活溶液，將第三正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第三熱滅活溶液，將第四正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第四熱滅活溶液；

步驟3.2.3，將第一紫外滅活溶液、第二紫外滅活溶液、第三紫外滅活溶液、第四紫外滅活溶液、第一熱滅活溶液、第二熱滅活溶液、第三熱滅活溶液和第四熱滅活溶液等體積混合均勻，4℃離心并收集沉淀，得到原生質體混合物沉淀；

步驟3.2.4，將原生質體混合物沉淀重懸于SMM緩沖液中，再加入相當于SMM緩沖液9倍體積的40％PEG 6000，室溫放置5min，得到重懸液，然后再加入與重懸液體積相同的SMM緩沖液，混勻并4℃離心，并用SMM緩沖液洗滌沉淀，得到洗滌后的沉淀物；

步驟3.2.5，將洗滌后的沉淀物重懸于SMM緩沖液中，涂布RM培養基平板，37℃避光培養至長出單菌落；

步驟3.2.6，挑取步驟3.2.5的單菌落，根據瓊脂柱法進行初篩，得到10株以上iturinA產量高的初篩菌株；

步驟3.2.7，將10株以上iturinA產量高的初篩菌株分別進行iturinA發酵，復篩出2-4株iturinA產量高的第一輪基因組改組菌株；

步驟3.2.8，利用第一輪基因組改組菌株制備第一輪基因組改組菌株的原生質體溶液；

然后以第一輪基因組改組菌株的原生質體溶液出發，采用步驟3.2.1-步驟3.2.7所述的方法，復篩出2-4株iturinA產量高的第二輪基因組改組菌株；

步驟3.2.9，對2-4株iturinA產量高的第二輪基因組改組菌株進行遺傳穩定性試驗分析和iturinA發酵，選取其中iturinA產量高且遺傳穩定性高的一株第二輪基因組改組菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌RH9。