[發明專利]一種解淀粉芽孢桿菌RH9、篩選方法及用途

在審

• 申請號: 201610651128.3
• 申請日: 2016-08-05
• 公開（公告）號: CN107058146A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發明（設計）人: 趙君峰;糾敏;原江鋒;符丹丹;李陽
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N15/03;C12P21/02;C12R1/07
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1.一種解淀粉芽孢桿菌RH9，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌RH9在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號為CGMCC12489，保藏日期為2016年5月23日。

2.根據權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，原始菌株解淀粉芽孢桿菌RH3的活化；

步驟2，初級誘變

步驟2.1，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行青霉素誘變，獲得iturinA產量高的第一正突變株和第二正突變株；

步驟2.2，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行亞硝基胍誘變，獲得iturinA產量高的第三正突變株和第四正突變株；

步驟3，基因組改組

步驟3.1，原生質體制備與再生

利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質體溶液；利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質體溶液；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質體溶液；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質體溶液；

步驟3.2，原生質體融合

步驟3.2.1，將第一正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第一紫外滅活溶液，將第二正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第二紫外滅活溶液，將第三正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第三紫外滅活溶液，將第四正突變株的原生質體溶液經紫外滅活處理得到第四紫外滅活溶液；

步驟3.2.2，將第一正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第一熱滅活溶液，將第二正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第二熱滅活溶液，將第三正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第三熱滅活溶液，將第四正突變株的原生質體溶液100℃滅活處理得到第四熱滅活溶液；

步驟3.2.3，將第一紫外滅活溶液、第二紫外滅活溶液、第三紫外滅活溶液、第四紫外滅活溶液、第一熱滅活溶液、第二熱滅活溶液、第三熱滅活溶液和第四熱滅活溶液等體積混合均勻，4℃離心并收集沉淀，得到原生質體混合物沉淀；

步驟3.2.4，將原生質體混合物沉淀重懸于SMM緩沖液中，再加入相當于SMM緩沖液9倍體積的40％PEG6000，室溫放置5min，得到重懸液，然后再加入與重懸液體積相同的SMM緩沖液，混勻并4℃離心，并用SMM緩沖液洗滌沉淀，得到洗滌后的沉淀物；

步驟3.2.5，將洗滌后的沉淀物重懸于SMM緩沖液中，涂布RM培養基平板，37℃避光培養至長出單菌落；

步驟3.2.6，挑取步驟3.2.5的單菌落，根據瓊脂柱法進行初篩，得到10株以上iturinA產量高的初篩菌株；

步驟3.2.7，將10株以上iturinA產量高的初篩菌株分別進行iturinA發酵，復篩出2-4株iturinA產量高的第一輪基因組改組菌株；

步驟3.2.8，利用第一輪基因組改組菌株制備第一輪基因組改組菌株的原生質體溶液；

然后以第一輪基因組改組菌株原生質體溶液出發，采用步驟3.2.1-步驟3.2.7所述的方法，復篩出2-4株iturinA產量高的第二輪基因組改組菌株；

步驟3.2.9，對2-4株iturinA產量高的第二輪基因組改組菌株進行遺傳穩定性試驗分析和iturinA發酵，選取其中iturinA產量高且遺傳穩定性高的一株第二輪基因組改組菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌RH9。

3.根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.1的利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質體溶液，具體按照以下步驟實施：制備第一正突變株的菌懸液，然后向第一正突變株的菌懸液中添加溶菌酶，并使溶液中溶菌酶的最終濃度為0.2mg/mL，之后37℃水浴15min，得到第一正突變株的原生質體溶液；

并且所述利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質體溶液的步驟；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質體溶液的步驟；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質體溶液的步驟，與利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質體溶液的步驟均相同。

4.根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.2.1的紫外滅活處理的條件為20W紫外燈，滅活60min。

5.根據權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.2.2的100℃滅活處理的時間為30min。