[發(fā)明專利]一種解淀粉芽孢桿菌RH9、篩選方法及用途在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610651128.3 | 申請日： | 2016-08-05 |
| 公開（公告）號： | CN107058146A | 公開（公告）日： | 2017-08-18 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 趙君峰;糾敏;原江鋒;符丹丹;李陽 | 申請（專利權(quán)）人： | 河南科技大學 |
| 主分類號： | C12N1/20 | 分類號： | C12N1/20;C12N15/01;C12N15/03;C12P21/02;C12R1/07 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 471023 *** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 淀粉 芽孢 桿菌 rh9 篩選 方法 用途 | ||
1.一種解淀粉芽孢桿菌RH9，其特征在于，所述解淀粉芽孢桿菌RH9在中國普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號為CGMCC12489，保藏日期為2016年5月23日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：
步驟1，原始菌株解淀粉芽孢桿菌RH3的活化；
步驟2，初級誘變
步驟2.1，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行青霉素誘變，獲得iturinA產(chǎn)量高的第一正突變株和第二正突變株；
步驟2.2，將活化后的解淀粉芽孢桿菌RH3進行亞硝基胍誘變，獲得iturinA產(chǎn)量高的第三正突變株和第四正突變株；
步驟3，基因組改組
步驟3.1，原生質(zhì)體制備與再生
利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液；
步驟3.2，原生質(zhì)體融合
步驟3.2.1，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第一紫外滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第二紫外滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第三紫外滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第四紫外滅活溶液；
步驟3.2.2，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第一熱滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第二熱滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第三熱滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第四熱滅活溶液；
步驟3.2.3，將第一紫外滅活溶液、第二紫外滅活溶液、第三紫外滅活溶液、第四紫外滅活溶液、第一熱滅活溶液、第二熱滅活溶液、第三熱滅活溶液和第四熱滅活溶液等體積混合均勻，4℃離心并收集沉淀，得到原生質(zhì)體混合物沉淀；
步驟3.2.4，將原生質(zhì)體混合物沉淀重懸于SMM緩沖液中，再加入相當于SMM緩沖液9倍體積的40％PEG6000，室溫放置5min，得到重懸液，然后再加入與重懸液體積相同的SMM緩沖液，混勻并4℃離心，并用SMM緩沖液洗滌沉淀，得到洗滌后的沉淀物；
步驟3.2.5，將洗滌后的沉淀物重懸于SMM緩沖液中，涂布RM培養(yǎng)基平板，37℃避光培養(yǎng)至長出單菌落；
步驟3.2.6，挑取步驟3.2.5的單菌落，根據(jù)瓊脂柱法進行初篩，得到10株以上iturinA產(chǎn)量高的初篩菌株；
步驟3.2.7，將10株以上iturinA產(chǎn)量高的初篩菌株分別進行iturinA發(fā)酵，復篩出2-4株iturinA產(chǎn)量高的第一輪基因組改組菌株；
步驟3.2.8，利用第一輪基因組改組菌株制備第一輪基因組改組菌株的原生質(zhì)體溶液；
然后以第一輪基因組改組菌株原生質(zhì)體溶液出發(fā)，采用步驟3.2.1-步驟3.2.7所述的方法，復篩出2-4株iturinA產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株；
步驟3.2.9，對2-4株iturinA產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株進行遺傳穩(wěn)定性試驗分析和iturinA發(fā)酵，選取其中iturinA產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定性高的一株第二輪基因組改組菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌RH9。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.1的利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液，具體按照以下步驟實施：制備第一正突變株的菌懸液，然后向第一正突變株的菌懸液中添加溶菌酶，并使溶液中溶菌酶的最終濃度為0.2mg/mL，之后37℃水浴15min，得到第一正突變株的原生質(zhì)體溶液；
并且所述利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟，與利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟均相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.2.1的紫外滅活處理的條件為20W紫外燈，滅活60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌RH9的篩選方法，其特征在于，步驟3.2.2的100℃滅活處理的時間為30min。
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