[發(fā)明專利]一套高效分泌表達(dá)異源蛋白的工程菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610649512.X
• 申請日: 2016-08-10
• 公開（公告）號: CN106282079B
• 公開（公告）日: 2019-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周志剛;潘興亮;楊雅麟;李志敏;李娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C07K14/195;C12N9/18;C12N15/75;C12R1/125
• 代理公司: 11245 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān)暢;白艷

本發(fā)明公開了一套高效分泌表達(dá)異源蛋白的工程菌及其應(yīng)用。本發(fā)明通過將胞內(nèi)質(zhì)量控制體系的相關(guān)基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE的敲除載體分別導(dǎo)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，分別獲得了對應(yīng)基因的缺失菌株，并在不同工程菌株中表達(dá)了CBP21和AIO6BS蛋白。通過實(shí)驗(yàn)證明：胞內(nèi)的質(zhì)量控制體系的相關(guān)基因的失活，不同程度的影響了CBP21和AIO6BS的蛋白表達(dá)。說明對胞內(nèi)質(zhì)量控制體系相關(guān)因子的改造，有利于提高外源蛋白的合成、穩(wěn)定折疊、分泌。同時本發(fā)明的一套胞內(nèi)蛋白酶敲除的工程菌株，為研究胞內(nèi)蛋白酶對外源蛋白的分泌表達(dá)的影響提供有效的工具，同時也為提高外源蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了一套工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一套高效分泌表達(dá)異源蛋白的工程菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

枯草芽胞桿菌，是芽胞桿菌屬的一種。單個細(xì)胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運(yùn)動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。

與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌能把表達(dá)的重組蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，簡化了下游處理的時間與成本，是一種理想的表達(dá)宿主。雖然芽孢桿菌能高效的分泌表達(dá)同源蛋白，但是異源蛋白，特別是在未修飾的宿主中，表達(dá)的質(zhì)量和產(chǎn)率不理想。質(zhì)量控制系統(tǒng)中的蛋白酶是影響重組蛋白表達(dá)的瓶頸之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種重組菌。

本發(fā)明提供的重組菌為如下(1)或(2)：

(1)所示的重組菌為降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白活性得到的菌；

(2)所示的重組菌為降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白活性得到的菌。

上述重組菌中，

所述降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白活性為抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因的表達(dá)；

所述降低和/或抑制枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白活性為抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因的表達(dá)。

上述重組菌中，

所述抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因的表達(dá)為敲除枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因或其部分片段；

所述抑制或沉默枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因的表達(dá)為敲除枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因或其部分片段。

上述重組菌中，

所述敲除枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因或其部分片段為將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因；

所述敲除枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因或其部分片段為將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因。

上述重組菌中，

所述將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因和所述將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因可以采用基因組定點(diǎn)編輯或同源重組的方式進(jìn)行；

所述基因組定點(diǎn)編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；

所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組或自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組。

上述重組菌中，

所述將枯草芽孢桿菌中YrrN蛋白編碼基因替換為抗性基因和所述將枯草芽孢桿菌中YwpE蛋白編碼基因替換為抗性基因均采用同源重組的方式進(jìn)行；