[發明專利]用于多重核酸測序的標簽和引物

有效

• 申請號: 201610645098.5
• 申請日: 2016-08-08
• 公開（公告）號: CN106282332B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 王緒敏;劉貴明;趙倍倫;宋利璞;于軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04;C12N15/11;C40B50/06
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本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及用于多重核酸測序的標簽和用于構建真菌ITS序列多重測序文庫的PCR引物。本發明提供的Index經過龐大數量的實際測序檢驗，將其包含于測序或建庫引物后，混合測序反應得到的測序數據平衡性相對較好，進而能夠更加真實可靠地反應樣品中的真菌組成情況。本發明提供的用于構建真菌ITS序列多重測序文庫的PCR引物比現有的常規ITS引物的特異性更高，不僅能夠對動物腸道、水體以及大曲等復雜性相對較低的樣品類型獲得高特異的擴增產物；對土壤和淤泥等高復雜性的樣品類型也具有較高的特異性，因此保障了后續測序結果的準確性，進而能夠獲得相對更加準確的分析結果和更加真實的真菌組成情況。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及用于多重核酸測序的標簽和用于構建真菌ITS序列多重測序文庫的PCR引物。

背景技術

微生物多樣性，尤其是真菌多樣性和農業、醫學、食品以及工業生產等諸多領域有密切聯系。隨著分子生物學技術的不斷發展，微生物多樣性研究方法也逐漸完善和成熟。在微生物進化過程中，核糖體RNA，具有一定的進化保守性，保守區序列為所有同類微生物所共有，在保守序列之間存在由于進化造成的物種之間序列差異的可變區域，因此被認為是最適合系統分類的基因之一。通過對這些序列可變區域的測定和比對，能夠探究并揭示土壤中微生物物種和群落結構的多樣性。隨著基因測序技術的發展，高通量測序技術憑借其獨特優勢也被引入微生物多樣性的研究技術中。

高通量測序技術(High-throughput sequencing)，又稱“下一代”測序技術(Next-generationsequencing technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。隨著高通量測序技術的不斷發展，為了節約測序成本或研究需要發展出了多重測序(Multiplexed sequencing)技術，通常在構建測序文庫時，借助PCR引物，用不同的標簽(Index)標記不同樣品后，將不同樣品混合起來上機測序，測序結束后通過識別Index來區分同一條泳道(Lane)中的不同樣品數據。多重測序技術極大程度的降低了測序成本，節約測序資源，并且給生物學研究提供的便利手段。例如，在進行實際的真菌多樣性研究時，通常需要對數百個樣品的多樣性進行分析，若沒有多重測序技術，科研成本和時間成本將大大增加。

用于區分不同樣品的標簽(Index)實際上為一段核苷酸序列，一方面在實際應用中發現，測序反應對不同的Index序列具有一定的數據產出偏好性，造成檢測插入片段時光強參數的波動，影響輸出的數據質量和平衡性，即Index序列一定程度影響混合樣品的測序數據的準確性，因此并非任何核苷酸序列都適合用作Index。鑒于目前已有的經過實際測序驗證的對數據平衡性較好的Index數目并不多，因此提供更多的對數據產出平衡性影響較小的Index序列對多重核酸測序技術非常重要。

另一方面，在真菌多樣性研究早期常使用18S rRNA作為分類鑒定的遺傳標記，隨著分子生物學技術的不斷發展，逐步采用ITS序列取代18S rRNA作為遺傳標記。盡管目前已有多種ITS序列擴增的通用引物，但其用于不同種類的樣品測序文庫構建時，并不能都獲得較好的擴增效果。比如用于土壤樣品的測序文庫構建時，由于土壤樣品本身的復雜性，目前常規的ITS通用引物獲得的PCR擴增產物彌散嚴重，擴增特異性相對較差。而擴增特異性直接影響分類鑒定的準確性，進而影響對樣品中真菌多樣性檢測的準確性。因此，提供一組高特異性的、用于真菌多樣性檢測的ITS序列多重測序文庫構建的PCR引物，能夠有效的提高對樣品中真菌多樣性檢測的準確性，進而對農業、醫學、食品以及工業領域的相關應用提供更加科學有效的指導。

再一方面，現有技術中僅有給細菌16SrRNA測序文庫樣品添加Index的試劑盒，Illunima公司的Nextera XT Index Kit和Nextera XT v2Index Kit；然而，目前并沒有用于給真菌ITS序列多重測序文庫樣品添加Index的試劑盒。