[發明專利]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT?PCR絕對定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610642978.7
• 申請日: 2016-08-08
• 公開（公告）號: CN107083448A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 翟新驗;吳佳俊;原霖;陳晨;張碩;韓燾;周智;倪建強;劉穎昳;訾占超;徐琦;李碩;王靜;馬付坤
• 申請（專利權）人: 中國動物疫病預防控制中心;北京佰鷗創投生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙)11498
• 代理人: 王加嶺

技術領域

本發明涉及試劑盒檢測技術領域，具體的說涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴數字RT-PCR(RT-ddPCR)絕對定量檢測方法和檢測試劑盒。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、尤其哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸性傳染病。本病在1987年首次暴發于美國，隨后在加拿大、歐洲與亞洲相繼出現，目前已經在世界范圍內流行，每年造成巨大的經濟損失。我國在1995年首次出現PRRS，隨后迅速蔓延。2006年在我國全面暴發了體溫高、發病率高、死亡率高為主要臨床特征的豬“高熱病”，而導致該病的病原是較之前在國內流行的經典PRRSV發生變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic PRRS，HP-PRRS)。目前為止，PRRSV有兩種型，歐洲型和美洲型，而美洲型又分為兩種亞型，經典美洲株和高致病性美洲株，三種亞型毒株在基因序列上存在一定差異。我國國內主要流行的為美洲型毒株，而歐洲株在國內也偶有發現，因此在臨床上需要一種能夠快速診斷PRRSV的檢測方法。

傳統的PRRSV檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(IPMA)、間接免疫熒光試驗(IFA)和間接酶聯免疫吸附試驗(間接ELISA)等。目前最常用核酸檢測方法有反轉錄-聚合酶鏈反應試驗(RT-PCR)等而熒光RT-PCR(Realtime RT-PCR)試驗。 傳統的PRRSV檢測方法存在需要使用高成本儀器設備，試驗所需時間較長等不足。RT-PCR和Realtime RT-PCR雖然較之以往方法具有特異性更強、靈敏度高、重復性好，且自動化程度高等特點，但是上述方法均只能實現定性和半定量的檢測，無法對病毒核酸進行精確定量，在靈敏度和敏感性特異性上仍存在一定的局限性。

數字化PCR(Digital PCR，dPCR)的概念早在1999年就由Bert Vogelstein采用并發表相關文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品(如尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常體細胞中檢測出微量的突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現數字PCR的核心理念——“無限稀釋”(terminal dilution)。Bio-Rad公司的QX200系統核心的微滴化技術能夠將一份樣品分成20,000個納升級的微滴，本質上將傳統定量PCR的一個test變成20,000個test，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度，是對“無限稀釋”這一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數字化PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)。QX200ddPCR系統包括兩臺儀器：微滴發生器和微滴分析儀，及其相關的耗材。微滴發生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。每個微滴都作為一個獨立的PCR反應器。隨后微滴轉移至96孔PCR板上，開展終點PCR擴增。采用微滴分析儀(droplet reader)逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數。與傳統的定量PCR相比，數字PCR的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數字PCR技術，研究人員可以檢測稀有突變，精確測定拷貝數變異，并對基因表達進行絕對定量。癌癥相關突變因濃度較低，往往逃過檢測。憑借QX200系統的高靈敏度，研究人員如今可檢測濃度低至1/1,000,000的靶分子。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、可實現精確定量的微滴數字RT-PCR檢測方法和微滴數字RT-PCR測試劑盒，用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的快速精確檢測。

本發明的第一個技術目的是提供用于檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物和探針組合，包括1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：

F：AGTGGGTCGGAGCACCAGTTC

R：CGCAGACACGAATCCAGAGGCT

P：FAM-AACTGTGACAACTGGAACGCTGACGCA-BHQ1。