[發明專利]高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT?PCR絕對定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610642978.7
• 申請日: 2016-08-08
• 公開（公告）號: CN107083448A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 翟新驗;吳佳俊;原霖;陳晨;張碩;韓燾;周智;倪建強;劉穎昳;訾占超;徐琦;李碩;王靜;馬付坤
• 申請（專利權）人: 中國動物疫病預防控制中心;北京佰鷗創投生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙)11498
• 代理人: 王加嶺

1.一種用于檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物和探針組合，其特征在于，包括1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：

F：AGTGGGTCGGAGCACCAGTTC

R：CGCAGACACGAATCCAGAGGCT

P：FAM-AACTGTGACAACTGGAACGCTGACGCA-BHQ1。

2.權利要求1所述的特異性引物和探針組合在制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒或檢測試劑中的應用。

3.一種含有權利要求1所述特異性引物和探針組合的試劑盒。

4.如權利要求3所述的試劑盒，其為微滴數字RT-PCR絕對定量檢測試劑盒。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含病毒總RNA提取試劑和檢測試劑；所述檢測試劑包括無RNA酶的蒸餾水，一步法RT-ddPCR探針法預混液，探針法RT-ddPCR微滴發生油，質控液，陰性對照和陽性對照。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組RNA的提取液，陰性對照為無RNA酶蒸餾水。

7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述一步法RT-ddPCR探針法預混液其900μl的配方為：500μL的2X One-step RT-ddPCR Supermix for probes，上、下游引物分別為90μL，特異探針為40μL，引物和探針的濃度均為10μM，以及無RNase酶蒸餾水180μL。

8.如權利要求4-7任一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的工作程序為：

(1)配制RT-ddPCR反應液；RT-ddPCR反應液20μl配方為：一步法RT-ddPCR探針法預混液18μl，待測樣品RNA模板為2μl；

(2)制備微滴，然后將微滴轉入PCR板，于PCR儀中進行擴增；

(3)將完成PCR擴增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數據，顯示檢測結果。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)中PCR的擴增程序為50℃反轉錄10min；95℃預變性10min；94℃變性30sec，57～60℃退火60sec，共40個循環；98℃10min結束反應，每步都設置2.5℃/sec的降溫速度。

10.權利要求3-9任一所述的試劑盒在豬疫病檢測和預防中的應用。