[發明專利]硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測5-羥甲基胞嘧啶中的應用

有效

• 申請號: 201610628830.8
• 申請日: 2016-08-03
• 公開（公告）號: CN106281309B
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 張靜;陳華艷;潘炯秀;張微;魏靜茹
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發明公開了一種硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測5?羥甲基胞嘧啶中的應用，其中所述的硼酸衍生物功能化熒光探針是表面固載2?(4?二羥基硼烷)苯基?4?羧基喹啉的聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球。本發明熒光探針不僅具有2?(4?二羥基硼烷)苯基?4?羧基喹啉的熒光特性，而且保留了聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球的良好生物兼容性，能夠特異性吸附糖基化后的5?羥甲基胞嘧啶，實現對5?糖基化胞嘧啶的簡單、快速、高靈敏度、低檢出限檢測。

技術領域

本發明屬于DNA中5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的檢測技術領域，具體涉及一種可特異性識別順式二羥基結構的2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)功能化熒光復合物傳感材料(PBAQA-P_GMA)在檢測DNA鏈中5hmC的應用。

背景技術

5-甲基胞嘧啶(5mC)在調控基因表達、基因組印記和X染色體失活中起著至關重要的作用。近來發現，5mC在TET(ten eleven translocation)家族雙加氧酶Fe²⁺/α-酮戊二酸的催化作用下可以被氧化為5hmC。5hmC作為一種1952年被發現至2009年才被再次發現進而得到廣泛研究的新型胞嘧啶變異體，目前已經被公認為是繼5mC之后的第六種堿基。該堿基在生物生理學過程中有著至關重要的作用。研究證明，5hmC是DNA去甲基化過程的重要中間產物，它可能是一種可以獨立存在較穩定的表觀遺傳修飾。研究還發現，在一些癌癥諸如肺癌、腦癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、前列腺癌中5hmC的含量明顯下降，證明其在癌癥發展過程中扮演者重要的角色。除此之外，5hmC在亨廷頓舞蹈癥、骨髓增生異常綜合癥、阿爾茲海默癥這些疾病中的分布也表現出異常。這些發現均預示5hmC將可能成為一種疾病診斷、處理和治療的新興生物學標志。

目前很多特定的技術已經被用于檢測組織中的5hmC，包括薄層色譜法、高效液相色譜串聯二級質譜法、同位素標記法、抗原抗體酶聯免疫技術等，但這些方法存在一些無法克服的缺點，比如需要用到放射性元素，無論是對人體還是環境都有害，檢測儀器昂貴，操作繁瑣等。基于此逐漸出現了光譜法檢測5hmC，如：將5hmC中的羥甲基氧化為醛基，通過醛基將一些熒光基團標記到DNA鏈上進行熒光檢測；氧化后通過熒光共振能量轉移法進行熒光檢測；通過糖基化反應將含有疊氮基團的糖基轉移到5hmC DNA鏈上，通過生物素標記、鏈霉親和素標記法進行熒光標記等。但這些熒光方法需要至少兩步提純過程，從而增大了DNA的損失率，而且操作過程繁瑣，有些難以避免背景因素干擾。

公開號為CN 104483295A的發明專利申請公開了一種基于硼酸衍生物功能化熒光探針檢測糖蛋白等二醇類物質的方法，該方法操作簡單，檢測靈敏度高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于為硼酸衍生物功能化熒光探針提供一種新的應用。

解決上述技術問題所采用的技術方案是：硼酸衍生物功能化熒光探針在檢測5-羥甲基胞嘧啶中的應用，所述硼酸衍生物功能化熒光探針是表面固載2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球，其中聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球的粒徑為150～400nm。

上述硼酸衍生物功能化熒光探針的制備方法為：將聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球(P_GMA)溶解于蒸餾水中，并加入過量乙二胺，在氮氣保護下，80℃反應完全后，離心、洗滌、干燥，得到氨基功能化的P_GMA；將氨基功能化的P_GMA分散于無水乙醇中，并依次加入2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉(PBAQA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中氨基功能化的P_GMA與PBAQA、EDC、NHS的摩爾量比為4:4:9:9，超聲分散均勻，40℃反應完全后，離心分離，產物依次用超純水、無水乙醇和乙腈洗滌，自然干燥，得到表面固載2-(4-二羥基硼烷)苯基-4-羧基喹啉的聚甲基丙烯酸環氧丙酯納米微球(PBAQA-P_GMA)，即硼酸衍生物功能化熒光探針。