[發(fā)明專利]一種透明化試劑、生物組織透明化成像方法及其應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2016-07-29
• 公開（公告）號: CN106323708B
• 公開（公告）日: 2019-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龔薇;斯科;祝欣培
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/30;G01N21/64
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林超

本發(fā)明公開了一種透明化試劑、生物組織透明化成像方法及其應(yīng)用。透明化試劑是由山梨糖醇、尿素、甘油和去污劑的四種主要成分溶于二甲基亞砜溶劑中形成；處理方法是將生物組織的固定和分離，再將生物組織浸泡在透明化試劑中，直到生物組織變得透明，對透明化的生物組織進行染色、制片和成像。本發(fā)明的透明化試劑成分市售，購買方便且便宜，方法簡單易行，大大縮減樣本處理所需的時間，不會產(chǎn)生明顯的組織膨脹或組織皺縮的負面效果，破壞程度小，表達熒光幾乎不淬滅，適用性廣泛。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及了一種生物試劑、處理方法及其應(yīng)用，涉及生物樣本處理和生物醫(yī)學成像領(lǐng)域的一種透明化試劑、生物組織透明化成像方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

腦組織透明技術(shù)是利用多種有機化合物或離子去污劑的混合試劑對腦組織進行處理，使其光學特性發(fā)生改變，由強散射介質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槿跎⑸浣橘|(zhì)，透光性增強，從而提高光學顯微鏡的成像深度，有利于實現(xiàn)對腦組織的三維重建和對神經(jīng)元空間結(jié)構(gòu)的解析。目前腦組織透明技術(shù)最常用的方法是CLARITY和CUBIC。由于CLARITY對腦組織進行丙烯酰胺凝膠包埋后用離子去污劑處理，凝膠的融入使得腦組織產(chǎn)生嚴重膨脹，離子去污劑強力的洗脫作用使得神經(jīng)細胞膜結(jié)構(gòu)被完全破壞。而CUBIC利用非離子去污劑的水溶液對腦組織進行處理，非離子去污劑緩和的作用使透明化過程需超過一周的時間且熒光信號產(chǎn)生嚴重的淬滅。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提出一種透明化試劑、生物組織透明化成像方法及其應(yīng)用，以縮短透明化時程，簡化操作步驟，減少組織結(jié)構(gòu)破損和熒光淬滅并獲得更好的成像效果。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下順序步驟：

一、一種透明化試劑：

透明化試劑是由山梨糖醇、尿素、甘油和去污劑的四種主要成分溶于二甲基亞砜溶劑中形成的混合試劑。山梨糖醇、尿素、甘油和去污劑溶于二甲基亞砜的質(zhì)量體積比分別是25％-35％、10％-30％、1％-5％、0％-5％。

所述的山梨糖醇為市售產(chǎn)品，可用于改變蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生組織透明效果并減緩腦組織的膨脹。

所述的尿素為市售產(chǎn)品，是主要的透明化成分，用于非破壞性的溶解細胞膜以及使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散化。

所述的甘油為市售產(chǎn)品，主要用于提高試劑的清澈度并部分減緩腦組織的膨脹。

所述的去污劑可為離子去污劑或非離子去污劑，如十二烷基磺酸鈉、Triton X-100、Tween 20或Tween 80市售產(chǎn)品，其可以在透明化試劑中選擇性加入，用于大程度的破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，加速透明化進程。

二、一種透明化試劑的應(yīng)用是在針對離體生物組織透明化處理和離體生物組織成像中的應(yīng)用，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)成像中的應(yīng)用。

三、一種生物組織透明化的成像方法，包括以下步驟：

A)生物組織的固定和分離；

B)將生物組織浸泡在透明化試劑中，直到生物組織變得透明，透明化試劑采用權(quán)利要求1所述的透明化試劑；

C)對透明化的生物組織進行染色、制片和成像。

本發(fā)明所述的生物組織指的是離體或者已經(jīng)死亡的生物組織。

所述步驟A中的生物組織為腦組織、胚胎、腎臟、脊柱、肝臟組織、腸道組織或者卵巢組織。

所述步驟A中的生物組織來源于爬行類、鳥類和哺乳類動物的生物體。

所述步驟A中具體是采用心臟灌流的方法進行：腹腔麻醉后，打開胸腔，經(jīng)心尖處將輸液器針頭穿入左心室，灌注生理鹽水或PBS(磷酸緩沖液)，剪開右心耳，沖洗體循環(huán)血液，血液沖洗完成后再灌注質(zhì)量濃度為4％的多聚甲醛溶液，完成后開顱取腦。