[發(fā)明專利]雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610606316.4
• 申請日: 2016-07-28
• 公開（公告）號: CN106220716B
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王宏俊;李淑芳;陳小玲;張培君;龔玉梅;李桂萍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C07K14/285
• 分類號: C07K14/285;C12N15/31;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11129
• 代理人: 吳泳歷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及家禽傳染病防疫領(lǐng)域，尤其涉及一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

雞傳染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由副雞禽桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)感染引起的最重要的呼吸疾病之一。患有雞傳染性鼻炎的雞主要呈現(xiàn)流鼻涕、眼瞼腫和溢淚等臨床癥狀。雞傳染性鼻炎可以導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋的延遲、產(chǎn)蛋量的下降，從而引起大量的經(jīng)濟(jì)損失。

Apg為巴氏桿菌科的一種短小革蘭氏陰性桿菌，基本特征為無運(yùn)動(dòng)性、菌體呈多形性、強(qiáng)毒株帶有莢膜。Page等人將Apg分為A、B和C三種血清型，研究表明A、B、C三個(gè)血清型的Apg均有不同程度的致病力，但三者的滅活菌體不存在型間交叉免疫。為了預(yù)防雞傳染性鼻炎，目前已經(jīng)廣泛使用了滅活疫苗，這些疫苗是通過以福爾馬林、硫柳汞等滅活副雞禽桿菌的細(xì)胞而獲得的。目前國際上普遍使用的滅活疫苗絕大多數(shù)都包含了A型和C型Apg，隨著國內(nèi)外陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有大量B型Apg的流行和發(fā)生，國際上影響較大的疫苗公司已經(jīng)開始提供包含A、B、C三種血清型的三價(jià)滅活疫苗。由于副雞禽桿菌屬于苛生菌，培養(yǎng)成本較高導(dǎo)致常規(guī)滅活菌苗成本居高不下；另外，副雞禽桿菌含有LPS等毒素物質(zhì)，大量接種所帶來毒副作用也會(huì)影響雞的產(chǎn)蛋與生長，在接種的雞中還會(huì)形成局灶性壞死斑。雞傳染性鼻炎滅活疫苗對野外雞群感染的預(yù)防效果大約為70-80％，在其效力檢驗(yàn)中由于環(huán)境和評價(jià)方法的差異可能會(huì)有不同的結(jié)果。

為了開發(fā)更為安全有效的疫苗，有學(xué)者研究了通過遺傳重組技術(shù)制備重組疫苗的可行性。例如，Ryuichi Sakamoto等人克隆表達(dá)了A型和C型副雞禽桿菌的外膜蛋白，獲得的重組蛋白可用作分別抵抗A型和C型雞傳染性鼻炎感染的保護(hù)性抗原。然而，在設(shè)計(jì)用于制備疫苗的重組抗原時(shí)，由于篩選A，B，C三種血清型Apg共有的、具有中和活性的抗原表位十分困難，目前還未見到能夠同時(shí)抵抗A，B，C三種血清型的副雞禽桿菌感染的保護(hù)性抗原的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

經(jīng)過發(fā)明人的深入研究，本發(fā)明提供一種新型副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，免疫原性強(qiáng)，以該抗原蛋白作為活性成分制備的亞單位疫苗能夠同時(shí)有效預(yù)防A型、B型和C型副雞禽桿菌的感染。

本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案如下：

一種副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白，其特征在于，包括氨基酸序列如Seq ID No.1～16所示的16個(gè)抗原表位或表位域。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的氨基酸序列選自Seq ID No.17，18，19，20和21之一。

編碼權(quán)利要求1所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的基因。

優(yōu)選地，所述基因的核苷酸序列選自Seq ID No.22，23，24，25和26之一。

一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求3或4所述的基因。

一種重組細(xì)胞，其特征在于，是由權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞而得；任選地，所述受體細(xì)胞選自細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗，其特征在于，其免疫活性組分包括權(quán)利要求1或2所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白。

優(yōu)選地，所述副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml。

一種雞傳染性鼻炎亞單位疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白的表達(dá)載體；

(2)用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化與之匹配的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，得到重組細(xì)胞；

(3)培養(yǎng)所述重組細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)獲得副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白并純化蛋白；

(4)將純化后的副雞禽桿菌免疫保護(hù)性抗原蛋白與輔助試劑混合，調(diào)節(jié)所述抗原蛋白的終濃度為5-100μg/ml，得到雞傳染性鼻炎亞單位疫苗。

優(yōu)選地，所述表達(dá)載體選自pET、pQE和pGEX系列的載體；所述蛋白表達(dá)系統(tǒng)選自大腸桿菌BL21、DH5ɑ、Top10和JM109菌株；所述輔助試劑包括免疫增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽溶液和/或蒸餾水。