[發明專利]C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610604720.8
• 申請日: 2016-07-28
• 公開（公告）號: CN106324239B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王明;吳艷芳;陳瑩
• 申請（專利權）人: 武漢景川診斷技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 倪婭;陳衛

本發明公開了一種C?反應蛋白免疫膠乳微球制備方法及應用，C?反應蛋白免疫膠乳微球制備方法優化化學交聯方法，將聚苯乙烯微球的羧基在低pH條件下活化，與高pH條件溶解的抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，在低溫下偶聯12～24h，既保證了抗體的偶聯效率，同時極大程度的降低了活化劑對抗體活性的破壞。采用本發明方法制備的免疫膠乳微球制成的膠乳增強免疫比濁法C?反應蛋白測定試劑盒具有靈敏度高、定量準確、重復性好、性質穩定的特點，其定量的線性范圍在0.1～20mg/L，可應用于全自動生化分析儀或凝血分析儀，操作快速、簡單，從檢測至采集結果只需5～10分鐘，具有較好的臨床應用前景。

技術領域

本發明涉及醫學免疫診斷領域，具體地指一種C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法及應用。

背景技術

C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)是一種在白介素-6的介導下主要由肝臟產生的急性期反應蛋白，急性期濃度可升高上千倍。

CRP無論在人或動物體內均是急性時相反應蛋白中重要的蛋白之一，是一種敏感的炎癥標志物，在急性創傷和感染時其血濃度急劇升高。正常動物血清CRP含量很低，但在感染、炎性、手術及腫瘤等情況下，幾個小時迅速升高，在狗體內24～48小時可達高峰。病變消退后，CRP可迅速下降至正常，所以可作為動物細菌和病毒感染的一個首選指標，防止抗生素濫用和減少食品帶來的健康問題。

1977年Sternberg創建了速率散射比濁法，是以測定的溶液對光的散射程度來判斷樣品中抗原的含量。一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物可導致光散射，散射強度與抗原抗體免疫復合物的含量成正比。但免疫比濁法由于檢測靈敏度達不到臨床的要求，于是出現了膠乳增強免疫比濁法。其基本原理是首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當遇到相應的抗原時，抗原抗體結合而出現膠乳凝集。單個膠乳顆粒的大小在入射光波長之內，光線可透過。當兩個以上膠乳顆粒凝集可阻礙光線透過，使透射光減少，其減少程度與膠乳凝集的程度成正比，亦與抗原成反比。

現有技術中常采用聚苯乙烯微球偶聯抗體，得到用于檢測的膠乳試劑，但偶聯效率普遍偏低，只有60～80％，且偶聯時碳化二亞胺類活化劑對抗體活性破壞較大，導致產品成品率低。

發明內容

本發明的目的就是要克服現有C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法產品成品率低的缺陷，提供一種偶聯效率高、偶聯后抗體活性影響小的C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法及由采用該C-反應蛋白免疫膠乳微球的膠乳增強免疫比濁法C-反應蛋白測定試劑盒。

為實現上述目的，本發明所提供的C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法，步驟如下：

1)準備粒徑范圍50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8～1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)將濃度≥10mg/mL的CRP多克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5～2mg/mL之間，得到CRP多克隆抗體溶液，儲存于2～8℃備用；

5)將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.05～0.2:1，整個滴加過程持續4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后0～4℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得C-反應蛋白免疫膠乳微球。