[發明專利]C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法及應用

有效

• 申請號: 201610604720.8
• 申請日: 2016-07-28
• 公開（公告）號: CN106324239B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 王明;吳艷芳;陳瑩
• 申請（專利權）人: 武漢景川診斷技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 倪婭;陳衛

1.一種C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法，步驟如下：

1)準備粒徑范圍50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8～1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液；

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)將濃度≥10mg/mL的CRP多克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5～2mg/mL之間，得到CRP多克隆抗體溶液，儲存于2～8℃備用；

5)將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.05～0.2:1，整個滴加過程持續4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后0～4℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得C-反應蛋白免疫膠乳微球。

2.根據權利要求1所述的C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法，其特征在于：所述步驟3)中震蕩活化條件為：4℃震蕩活化1h，震蕩速度為50r/min。

3.根據權利要求1或2所述的C-反應蛋白免疫膠乳微球制備方法，其特征在于：所述步驟5)中使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合時，4℃震蕩16h，震蕩速度為50r/min。

4.一種膠乳增強免疫比濁法C-反應蛋白測定試劑盒，其特征在于：包括C-反應蛋白檢測試劑R1和C-反應蛋白檢測試劑R2；

所述C-反應蛋白檢測試劑R1中各組分及含量為：0.01～13％穩定劑1、10～200mM的緩沖液1、1～6％的促凝劑1、0.02～0.1％的防腐劑1；

所述C-反應蛋白檢測試劑R2中各組分及含量為：0.01～23％穩定劑2、1～5mg/ml的C-反應蛋白免疫膠乳微球、10～200mM的緩沖液2、0.02～0.1％的防腐劑2；

其中，所述穩定劑1選自0.5～1.8％的氯化鈉、0.1～1％的BSA、1～20mM的乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的Triton X-100中的一種或兩種以上；

所述緩沖液1選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；

所述促凝劑1選自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一種；

所述防腐劑1選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種；

所述穩定劑2選自0.5～1.8％的氯化鈉、0.2～3％的BSA、1～20mM乙二胺四乙酸二鈉、0.01～1％的Triton X-100、1～10％的丙三醇中的一種或兩種以上；

所述緩沖液2選自4-羥乙基哌嗪乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸-氫氧化鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液中的一種或兩種以上；

所述防腐劑2選自疊氮鈉、Proclin300或硫柳汞中的一種；

所述C-反應蛋白檢測試劑R2的制備方法為：

1)準備粒徑范圍50～200nm的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球首先用濃度為50mmol/L的2-嗎啉乙磺酸緩沖液稀釋至終濃度0.8～1.2％w/v，得到pH為5.5～6.5的微球溶液；

2)以2-嗎啉乙磺酸緩沖液溶解碳化二亞胺，得到濃度為10mg/mL的碳化二亞胺溶液，

3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量為計，按每10mg聚苯乙烯微球添加50～60μL的比例將碳化二亞胺溶液滴加至微球溶液中，2～8℃震蕩活化1h，震蕩速度為30～50r/min，得到活化聚苯乙烯微球溶液；

4)將濃度≥10mg/mL的CRP多克隆抗體在pH8.5～9.5條件下溶解，溶劑是50mmol/L的硼酸鹽緩沖液，使抗體終濃度在0.5～2mg/mL之間，得到CRP多克隆抗體溶液，儲存于2～8℃備用；

5)將CRP多克隆抗體溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中，直至抗體與微球質量比為0.05～0.2:1，整個滴加過程持續4～7min，使活化聚苯乙烯微球與抗體上的氨基耦合，兩者的混合液呈中性，之后0～4℃震蕩12～24h，震蕩速度為30～50r/min，即得C-反應蛋白免疫膠乳微球；

6)向C-反應蛋白免疫膠乳微球中加入含有穩定劑2和緩沖液2的封閉液，震蕩得到膠乳溶液；

7)膠乳溶液離心，去上清液，以除去其中殘留的活化劑，然后加入包含防腐劑2的貯存液至貯存濃度，超聲分散，即得。