[發明專利]重組酶聚合酶擴增試劑盒、擴增方法及擴增試劑

在審

• 申請號: 201610587482.4
• 申請日: 2016-07-22
• 公開（公告）號: CN107641635A
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 盛司潼;龔敬文
• 申請（專利權）人: 廣州康昕瑞基因健康科技有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種恒溫擴增技術，更具體地說，涉及一種重組酶聚合酶擴增（RPA）試劑盒、擴增方法及擴增試劑。

背景技術

傳統的體外DNA擴增主要是采用聚合酶鏈式反應（PCR）的方法，目前已經廣泛應用于生物醫學等領域。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成：（1）模板DNA的變性，模板DNA經加熱至90-95℃一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；（2）模板DNA與引物的退火，模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55-60℃，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；（3）引物的延伸，DNA模板—引物結合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃條件下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2-4分鐘，2-3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。PCR技術的優點顯而易見，但由于其需要精密的溫度循環儀器才能完成擴增過程，對儀器的依賴程度較高，加之成本高、反應耗時長，這些局限性使其應用大多限制于條件良好的實驗室內，難以廣泛應用于現場檢測。

因此，需要一種提供不依賴于PCR儀等溫度循環儀器的擴增方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組酶聚合酶擴增試劑盒、擴增方法及擴增試劑，在恒溫條件下實現對特定核酸序列的高效擴增，使得核酸擴增的過程可以直接在無需PCR儀等溫度循環儀器的條件下完成。

本發明提供了一種重組酶聚合酶擴增試劑盒，所述試劑盒包括以下組分：Ecoli RecA蛋白、λ phage Orf蛋白、Ecoli SSB蛋白及DNA聚合酶。

優選的，所述試劑盒還包括擴增反應緩沖液，所述擴增反應緩沖液包括Tris 緩沖液，所述擴增反應緩沖液還包括聚乙二醇、二硫蘇糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一種或多種。

優選的，所述試劑盒還包括鎂離子制劑。

本發明還提供了一種重組酶聚合酶擴增方法，所述方法包括以下步驟：

A、配置反應體系，所述反應體系包括：模板核酸分子、引物組、Ecoli RecA蛋白、λ phage Orf蛋白、Ecoli SSB蛋白、DNA聚合酶、dNTP、ATP及擴增反應緩沖液，所述擴增反應緩沖液包括Tris 緩沖液；

B、向所述反應體系中加入鎂離子制劑；

C、在20至65℃條件下進行擴增反應。

優選的，所述擴增反應緩沖液還包括聚乙二醇、二硫蘇糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一種或多種。

優選的，所述引物組包括一對引物，所述引物的長度為30至65bp。

優選的，所述Ecoli RecA蛋白濃度為20至250ng/μL；所述λ phage Orf蛋白濃度為20至80ng/μL；所述Ecoli SSB蛋白的濃度為200至1000ng/μL。

本發明還提供了一種重組酶聚合酶擴增試劑，所述試劑包括：Ecoli RecA蛋白、λ phage Orf蛋白、Ecoli SSB蛋白及DNA聚合酶。

優選的，所述擴增試劑還包括擴增反應緩沖液，所述擴增反應緩沖液包括Tris 緩沖液；所述擴增反應緩沖液還包括聚乙二醇、二硫蘇糖醇、磷酸肌酸和肌酸激酶中的一種或多種。

優選的，所述Ecoli RecA蛋白濃度為20至250ng/μL；所述Ecoli SSB蛋白濃度為200至1000ng/μL；所述λ phage Orf蛋白濃度為20至80ng/μL。

本發明的重組酶聚合酶擴增試劑盒，采用Ecoli RecA蛋白、Ecoli SSB蛋白及λ phage Orf蛋白協同作用的擴增體系，擴展了重組酶聚合酶擴增的應用范圍；與傳統PCR技術相比，本發明的重組酶聚合酶擴增反應在恒溫條件下即可進行，無需PCR儀等溫度循環儀器，不受實驗空間限制；本發明的擴增反應在10至60分鐘即可完成，遠快于PCR技術或其他等溫擴增技術。

附圖說明

圖1是第一具體實施例中重組酶聚合酶擴增及對照PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

圖2是第二具體實施例中重組酶聚合酶擴增的毛細管電泳檢測圖。

圖3是第三具體實施例中重組酶聚合酶擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

圖4是第四具體實施例中重組酶聚合酶擴增的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖。

具體實施方式