[發明專利]一種誘導杜鵑蘭原球莖芽簇增殖的方法

有效

• 申請號: 201610578050.7
• 申請日: 2016-07-21
• 公開（公告）號: CN106171998B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 張明生;吳彥秋;呂享;葉睿華;李小蘭
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李余江;程新敏

本發明公開了一種誘導杜鵑蘭原球莖芽簇增殖的方法，該方法包括以下步驟：1)以杜鵑蘭人工授粉的種子進行無菌萌發獲得的原球莖為外植體；2)將原球莖置于1/2MS基本培養基中進行增殖培養；3)將增殖后的原球莖置于1/4MS基本培養基中誘導芽簇；4)將上述芽簇未分化與分化部分進行分割后置于不同培養基中進行芽簇增殖和分化出苗培養；5)將出苗植株置于1/4MS基本培養基中進行生根培養。取杜鵑蘭組培苗進行煉苗并移栽到適宜其生長的基質中，直至長成健壯的杜鵑蘭植株。本發明方法有效地提高了杜鵑蘭種苗的繁殖系數，為實現其規?；a奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及植物組織培養與快速繁殖方法，具體涉及一種誘導杜鵑蘭原球莖芽簇增殖的方法。

背景技術

杜鵑蘭[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]為蘭科杜鵑蘭屬的野生珍稀藥用植物，以其干燥假鱗莖入藥。杜鵑蘭假鱗莖含有生物堿、黃烷酮類、苷元、菲類等成分，內用具有抗肝癌、乳腺癌、子宮癌等功效，外用可治瘡毒、蛇蟲咬傷、皮膚燙傷或燒傷等。

杜鵑蘭自然有性繁殖困難，在長期演化過程中適應了假鱗莖的營養繁殖，逐年產生的假鱗莖形成假鱗莖串，但每年僅由最新的假鱗莖發芽長成新植株、形成一個新假鱗莖，故繁殖系數極低。在人工種植中，可將假鱗莖串分株繁殖，雖在一定程度上提高了繁殖系數，但依然無法實現其規?；a。通過人工授粉雖可獲得種子，但其種胚敗育，難以自然萌發成苗。加之人們長期的掠奪式采挖，導致杜鵑蘭野生資源日漸枯竭，研究其有效的繁殖技術迫在眉睫。

發明內容

本發明提供了一種誘導杜鵑蘭原球莖芽簇增殖的方法，該方法能夠有效地提高杜鵑蘭的繁殖系數，縮短其生長周期，為實現其工廠化育苗與藥材規?；a奠定了基礎。

本發明采用的技術方案：首先以杜鵑蘭種子無菌萌發獲得的原球莖作為外植體材料，然后通過組織培養獲得適于誘導芽簇的原球莖，再通過對基本培養基、蔗糖濃度、植物生長調節物質等的篩選及優化，建立原球莖誘導芽簇的適宜條件，最后以芽簇增殖培養批量生產試管苗，經煉苗、移栽，獲得大量健壯的杜鵑蘭植株。

具體步驟如下：

步驟1：采用人工授粉獲得的杜鵑蘭種子經培養基無菌萌發獲得的原球莖為外植體；

步驟2：將步驟1中的外植體接種于原球莖增殖培養基上，置于溫度15℃、光照時間12h·d^-1、光照強度2000 lx的光照培養箱內培養，40d后原球莖顏色由白色轉為黃綠色，形成簇狀原球莖且表面有白色毛狀物；

步驟3：挑選步驟2中生長健壯的原球莖，以不含蔗糖1/4MS、1/2MS或MS為基本培養基，分別添加TDZ 1.5～2.5mg·L^-1+NAA0.1～0.3mg·L^-1+蔗糖10～30g·L^-1進行培養，培養溫度為(25±2)℃，其他培養條件同步驟2，30d后原球莖分化形成芽簇；

步驟4：將步驟3中誘導形成的芽簇分割成兩部分，一部分是芽簇中未分化的原球莖，將其接入步驟3中芽簇誘導培養基中繼續誘導芽簇形成；另一部分是基部明顯膨大且具有分化成苗趨勢的原球莖，將其接入生根培養基進行生根培養，30d后形成具有3～5條長為2～3cm根的健壯杜鵑蘭幼苗，培養條件同步驟3；

步驟5：將步驟4中成功誘導生根的健壯杜鵑蘭幼苗轉至煉苗室，3～5d后，打開封口膜取出幼苗，洗凈幼苗根上附著的培養基，并吸干水分，然后用800倍多菌靈溶液浸泡其根5min，移栽到苗床上，噴水保濕，2個月后移栽上盆，即獲得生長健壯的杜鵑蘭植株。

作為優選方案，步驟3中選取生長健壯的原球莖，以不含蔗糖的1/4MS為基本培養基，外加TDZ 1.5mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1，培養溫度為(25±2)℃。