[發明專利]新型自組裝膠原蛋白及制備方法

有效

• 申請號: 201610574213.4
• 申請日: 2016-07-19
• 公開（公告）號: CN107630059B
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發明（設計）人: 裴雪濤;南雪;游子娟;單紫筠;魏紅;姚海雷;賈茜媛;龍冬瑩
• 申請（專利權）人: 華南生物醫藥研究院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明公開了自組裝膠原蛋白及其制備方法和用途，其中，自組裝膠原蛋白制備方法包括以下步驟：利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對動物源膠原蛋白進行酶解處理，以便獲得含有小分子肽的酶解產物；對所述酶解產物進行超濾處理，以便獲得膠原蛋白多肽溶液；將所述膠原蛋白多肽溶液與醋酸混合后進行透析處理以便獲得所述自組裝膠原蛋白，其中，所述透析處理采用磷酸鹽緩沖液作為透析外液。該方法采用特定蛋白酶水解膠原蛋白，不僅得到低分子量的膠原多肽溶液，并且可以在肽的末端產生特定的“粘性末端”，通過自組裝形成可以在體內起到更好地支撐器官、保護機體作用的膠原纖維。

技術領域

本發明涉及蛋白質工程領域，具體的，本發明涉多肽分子自組裝領域，更具體的，本發明涉及自組裝膠原蛋白及其制備方法和用途。

背景技術

膠原蛋白是一種動物體內由纖維原細胞合成產生的天然蛋白，是細胞外基質的結構蛋白，又稱膠原，廣泛存在于動物的骨豁、皮膚、肌腱等結締組織中，使組織和器官具有良好的機械力學結構，從而起到支撐器官、保護機體的作用。(Gly-X-Y)n重復氨基酸序列單元是構成膠原三螺旋結構的分子基礎，其中甘氨酸(Gly)占據三螺旋的軸心位置、脯氨酸和羥脯氨酸分別在X和Y位置上高頻出現并對三螺旋的穩定性發揮重要作用。膠原蛋白及其降解產物富含甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等天然保濕因子和大量的親水基團，因而它具有保濕功能。另外，膠原蛋白具有良好的滲透性，能填充在皮膚基質之間且被皮膚吸收，具有修復皮膚和美白的作用，因此膠原及其降解產物膠原肽在美容保健和化妝品中的應用越來越廣泛。

由于從組織提取的膠原蛋白分子量比較大，一般為200kDa左右，而分子量大于4kDa的物質很難進入人皮膚的真皮層，導致人體對膠原蛋白的吸收效率低。因此，通過體外蛋白酶的水解作用，生成分子量為1kDa左右的膠原蛋白寡肽，這些小肽能夠被皮膚吸收，能促進氨基酸吸收和機體蛋白質的合成。采用特異性酶水解膠原蛋白得到膠原蛋白寡肽，膠原蛋白在水解為多肽時其三螺旋結構遭到破壞，起不到支撐器官、保護機體的作用。

多肽自組裝技術是指利用多肽分子在熱力學平衡條件下通過非共價鍵間的相互作用自發形成穩定的聚集態結構。自組裝機理是利用多肽分子的非共價鍵，如分子間的氫鍵、離子鍵、鹽鍵等自發形成多肽聚集體。膠原蛋白的自組裝過程十分復雜，目前的研究大多數集中在考察膠原蛋白的濃度、自組裝時間、溶液pH、電解質、基底等因素對膠原蛋白自組裝過程的影響。

因而，對自組裝前膠原蛋白樣本的制備方法仍有待改進。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠制備具有良好的支撐器官、保護機體等生物功能的自組裝膠原蛋白的方法。

本發明是基于發明人的下列發現而完成的：由于膠原蛋白富含谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸等帶電氨基酸，可以通過蛋白酶水解得到末端為特定氨基酸的肽段，比如末端為帶正電的谷氨酸和負電的賴氨酸，從而形成“粘性末端”，能夠促使膠原蛋白多肽自組裝形成膠原纖維。

因而，根據本發明的一個方面，本發明提供了一種制備自組裝膠原蛋白的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟：利用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對動物源膠原蛋白進行酶解處理，以便獲得含有小分子肽的酶解產物；對所述酶解產物進行超濾處理，以便獲得膠原蛋白多肽溶液；將所述膠原蛋白多肽溶液與醋酸混合后進行透析處理以便獲得所述自組裝膠原蛋白，其中，所述透析處理采用磷酸鹽緩沖液作為透析外液。

發明人驚奇的發現，利用本發明的制備自組裝膠原蛋白的方法，采用特定蛋白酶水解膠原蛋白，不僅得到低分子量的膠原多肽溶液，并且可以在肽的末端產生特定的“粘性末端”，通過自組裝形成膠原纖維。單純用蛋白酶水解膠原蛋白成為小肽段，能夠被人體有效吸收，但是并不能在體內自組裝成膠原蛋白，不能更好地起到支撐器官、保護機體的作用。因此，將膠原蛋白用特異性蛋白酶水解使其產生“粘性末端”，并通過自組裝形成膠原纖維，從而可以更好地發揮其生物功能。