[發明專利]一種林蛙皮透明質酸的提取方法

有效

• 申請號: 201610574174.8
• 申請日: 2016-07-19
• 公開（公告）號: CN107629145B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 裴雪濤;南雪;游子娟;單紫筠;岳文;魏紅;姚海雷;吳旭敏;練利芳
• 申請（專利權）人: 華南生物醫藥研究院
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發明提出了一種林蛙皮透明質酸的提取方法，包括：(1)獲取林蛙皮粉；(2)利用蒸餾水對林蛙皮粉進行溶解；(3)將林蛙皮粉溶解液進行超高壓處理；(4)利用胰酶和堿性蛋白酶對超高壓浸出液進行酶解處理；(5)向酶解液中添加乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀并進行干燥處理；(6)利用氯化鈉對經過干燥處理后的沉淀進行溶解；(7)向沉淀的溶解液中添加過氧化氫進行脫色；(8)調節pH至4.5?5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，離心分離出蛋白并收集水相；(9)對水相進行透析，收集透析液；(10)對透析液進行醇沉和干燥處理，以便得到透明質酸精品。該方法工藝簡單，透明質酸提取率高、純度高且活性好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，本發明涉及一種林蛙皮透明質酸的提取方法。

背景技術

透明質酸(Hyaluronic acid，簡稱HA)是一種由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸為結構單元以β-1，4-糖苷鍵縮合而成的二糖單元，二糖單元再由β-1，3-糖苷鍵反復交替連接形成HA鏈。HA鏈長度最高可達25，000個二糖單元，相對分子質量在10⁴-10⁷道爾頓之間。

HA在醫藥、食品和化妝品等領域具有廣泛的應用，具有獨特的保濕性能。它可以作為傷口愈合，促進術后粘連作用，可以作為原始材料合成具有抗炎、止痛等作用的新藥。由于HA分子中含有的大量羧基和羥基，可與水形成氫鍵而具有很強的保水能力。因此，HA被當做天然的保濕因子廣泛應用到化妝品中。

目前可以通過動物組織提取和微生物發酵生產兩種方式得到HA，由于目前微生物發酵生產機制尚未成熟，正處于研究階段，而動物組織提取操作簡單，方便，因此適合小規模的生產需要。HA廣泛存在于動物的組織、器官中，如雞冠、牛眼玻璃體、人的臍帶以及蛙皮等中含有較多的透明質酸。

中國林蛙(Rana Chensinensis)是一種集藥用、食補、美容三種兼容的經濟動物。中國東北的林蛙多被制成“哈士蟆油”，其中林蛙皮即林蛙軀干表明的皮膚就作為蛤蟆油的副產品，每年數百噸林蛙皮被廢棄或者作為飼料用。林蛙皮中含有大量的膠原蛋白、氨基酸以及透明質酸等活性物質，具有良好的應用價值。因此，從林蛙皮中提取透明質酸具有明顯的優勢，將提升我國對林蛙產業的經濟效益。

目前，從林蛙皮中提取透明質酸的研究甚少，其提取工藝研究也不明確。沙坤等從林蛙皮中提取HA工藝是：通過蛋白酶初步酶解，經過氯仿除去蛋白質，再經過二次酶解，最后用季銨鹽進行純化后用超濾膜超濾進行脫色。這個方法是傳統的制備HA的方法，缺點的是：步驟繁瑣，造成HA提取率低；同時用了氯仿和季銨鹽等多種有毒物質對人和環境不友好。張輝等通過陶瓷膜過濾法從林蛙皮中分離提取HA，只采用單一酶胃蛋白酶水解之后，選擇一定孔徑的陶瓷膜過濾除雜蛋白，HA提取率不高。

因此，目前對于從林蛙皮中提取透明質酸的工藝有待進一步改進。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種從林蛙皮中提取透明質酸的方法，該方法工藝流程簡單，提取率高且提取純度高、活性好。

根據本發明的一個方面，本發明提出了一種從林蛙皮中提取透明質酸的方法，包括：

(1)獲取林蛙皮粉；

(2)利用蒸餾水對所述林蛙皮粉進行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)將所述林蛙皮粉溶解液在超高壓容器內進行超高壓處理，以便得到超高壓浸出液；

(4)利用胰酶和堿性蛋白酶對所述超高壓浸出液進行酶解處理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍體積的95％乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀并進行干燥處理；

(6)利用氯化鈉對經過所述干燥處理后的沉淀進行溶解；