[發(fā)明專利]一種林蛙皮透明質酸的提取方法

有效

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• 申請日: 2016-07-19
• 公開（公告）號: CN107629145B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 裴雪濤;南雪;游子娟;單紫筠;岳文;魏紅;姚海雷;吳旭敏;練利芳
• 申請（專利權）人: 華南生物醫(yī)藥研究院
• 主分類號: C08B37/08
• 分類號: C08B37/08
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

1.一種從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，包括：

(1)獲取林蛙皮粉；

(2)利用蒸餾水對所述林蛙皮粉進行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)將所述林蛙皮粉溶解液在超高壓容器內進行超高壓處理，以便得到超高壓浸出液；

(4)利用胰酶和堿性蛋白酶對所述超高壓浸出液進行酶解處理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍體積的95％乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀并進行干燥處理；

(6)利用0.1-0.5mol/L氯化鈉對經過所述干燥處理后的沉淀進行溶解；

(7)向溶解的沉淀中添加過氧化氫進行脫色處理；

(8)調節(jié)經過所述脫色處理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，攪拌4h，離心分離出蛋白并收集水相；

(9)利用磷酸鹽緩沖液對所述水相進行透析，收集透析液；

(10)向所述透析液中添加2-3倍體積的95％乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀并進行干燥處理，以便得到透明質酸精品；

其中步驟(3)中，所述超高壓處理是在200-400Mpa的壓力下保持2-5min，并在2s內卸除壓力而完成的；

步驟(4)中，所述酶解處理按照下列步驟進行：

(4-1)調節(jié)所述超高壓浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中進行第一酶解2-4h，沸水浴滅活所述胰酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的堿性蛋白酶并于50℃的水浴中進行第二酶解3-6h，沸水浴滅活所述堿性蛋白酶，以便得到第二酶解液；

或者所述酶解處理按照下列步驟進行：

(4-1)調節(jié)所述超高壓浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的堿性蛋白酶并于50℃的水浴中進行第一酶解3-6h，沸水浴滅活所述堿性蛋白酶，以便得到第一酶解液；

(4-2)向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中進行第二酶解2-4h，沸水浴滅活所述胰酶，以便得到第二酶解液。

2.根據權利要求1所述的從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述溶解按照下列步驟進行：

(2-1)將所述林蛙皮粉溶于蒸餾水中，磁力攪拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(2-2)將步驟(2-1)得到的溶液在20-35KHz和100-300W條件下超聲處理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液。

3.根據權利要求1所述的從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，步驟(5)和步驟(10)中的干燥處理是在40-60℃的真空干燥箱中進行的。

4.根據權利要求1所述的從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，步驟(7)中，所述脫色處理是通過向溶解的沉淀中添加0.5-1.5體積％的過氧化氫、并調節(jié)pH至7.0-7.5，于40-60℃的水浴中進行4-10h完成的。

5.根據權利要求1所述的從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，步驟(8)中，向所述脫色處理后的溶液中加入等體積的所述混合溶液。

6.根據權利要求1所述的從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，所述混合溶液中氯仿與正丁醇的體積比為4：1。

7.一種從林蛙皮中提取透明質酸的方法，其特征在于，包括：

(1)獲取新鮮剝離的林蛙皮，除去皮下組織及粘連物，清洗，室溫干燥，粉碎，以便獲得林蛙皮粉；

(2)溶解：將所述林蛙皮粉按照1g：10ml的質量體積比溶于蒸餾水中，磁力攪拌4-8h，于4℃冰箱放置至少12h；

(3)超聲波處理：將步驟(2)得到的溶液在20-35KHz和100-300W條件下超聲處理20-30min，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(4)超高壓處理：將所述林蛙皮粉溶解液在200-400Mpa的壓力下保持2-5min，并在2s內卸除壓力完成超高壓處理，以便得到超高壓浸出液；

(5)酶解：調節(jié)所述超高壓浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的胰酶并于37℃的水浴中進行第一酶解2-4h，沸水浴滅活所述胰酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的堿性蛋白酶并于50℃的水浴中進行第二酶解3-6h，沸水浴滅活所述堿性蛋白酶，以便得到第二酶解液，或者

調節(jié)所述超高壓浸出液的pH值至8.0-8.5，添加1％的堿性蛋白酶并于50℃的水浴中進行第一酶解3-6h，沸水浴滅活所述堿性蛋白酶，以便得到第一酶解液；向所述第一酶解液中添加1％的胰酶并于37℃的水浴中進行第二酶解2-4h，沸水浴滅活所述胰酶，以便得到第二酶解液；

(6)濃縮：向所述酶解液中添加2-3倍體積的95％乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀，將沉淀在40-60℃的真空干燥箱中進行干燥處理；

(7)利用0.1-0.5mol/L氯化鈉對經過所述干燥處理后的沉淀進行溶解；

(8)向溶解的沉淀中添加0.5-1.5體積％的過氧化氫并于40-60℃的水浴中進行脫色處理4-10h；

(9)調節(jié)經過所述脫色處理后的溶液的pH至4.5-5.0，并加入等體積的氯仿和正丁醇的混合溶液，攪拌4h，離心分離出蛋白并收集水相，所述混合溶液中氯仿與正丁醇的體積比為4：1；

(10)利用pH 7.0的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液對所述水相進行透析，收集透析液；

(11)向所述透析液中添加2-3倍體積的95％乙醇以便生成沉淀，離心收集沉淀并將沉淀在40-60℃的真空干燥箱中進行干燥處理，以便得到透明質酸精品。