[發明專利]一種檢測母乳中低聚糖的方法

有效

• 申請號: 201610556457.X
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN107621399B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 陳歷俊;趙軍英;魏京華;姜鐵民;董學艷;李菊芳;張毅
• 申請（專利權）人: 北京三元食品股份有限公司
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N1/40;G01N30/14;G01N30/02
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

本發明涉及一種檢測母乳中低聚糖的方法，包括對母乳樣品進行前處理的步驟，所述前處理具體為：取母乳樣品，離心除去上層脂肪，取下層液體并加入醇類溶劑，于﹣40℃～﹣100℃冷凍5?15min后，離心，取上清液，即得；本發明還提供了采用液質法對前處理后的母乳中的低聚糖進行定性和定量檢測的方法；本發明建立起了一種非還原母乳液質聯用同時檢測母乳中多種低聚糖的方法，具有前處理簡單、快速、有效的優勢，質譜采用Q Exactive檢測器，確定了液相梯度洗脫的參數和質譜檢測的參數，給出了非還原母乳低聚糖在正離子模式下質譜檢測時的離子信息，能夠很好地用于母乳低聚糖的定性和定量檢測。

技術領域

本發明屬于分析檢測技術領域，尤其涉及一種檢測母乳中低聚糖的方法，更具體地，涉及一種采用液質法檢測母乳中低聚糖的方法。

背景技術

母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMO)是人類母乳中僅次于乳糖和脂肪的第3大組分，在初乳中含量高達22～23g/L，成熟乳中為12～13g/L。HMO具重要的生物學功能，不僅具有抵御腸道病原微生物感染的功能，還有維持腸道微生態平衡的作用。母乳成分是嬰幼兒奶粉制備的黃金標準，因此建立母乳低聚糖的檢測方法，是分析母乳成分進而開發更加營養健康的嬰幼兒奶粉的必要前提。

目前，母乳低聚糖的檢測方法主要有四種：離子色譜、高效液相色譜、液質聯用、毛細管電泳色譜。各種方法具體如下：

1)液質聯用若配有飛行時間檢測器和相應的色譜柱(多孔石墨碳色譜柱較多)可以檢測到多達300種母乳低聚糖；但液質聯用檢測母乳需進行較為復雜的預處理(Tottenet al.,Rapid-throughput glycomics applied to human milk oligosaccharideprofiling for large human studies,2014,Journal,406(Issue),7925-7935)：加水離心脫脂→加乙醇脫蛋白→用NaBH₄還原→【石墨碳固定相萃取：去離子水水洗脫鹽→洗脫(20％乙腈水溶液，40％乙腈和0.05％三氟乙酸溶液)】→冷凍干燥→去離子水溶解→液質聯用檢測。

2)毛細管電泳色譜若配有熒光檢測器，也可同時分離多種母乳低聚糖的同分異構體，若使用UV檢測器，只能檢測部分低聚糖，例如唾液酸相關的低聚糖。毛細管電泳色譜母乳處理如下(Albrecht et al.,CE-LIF-MS n profiling of oligosaccharides in humanmilk and feces of breast-fed babies,2010,Journal,31(Issue),1264–1273)：加水離心脫脂→加乙醇脫蛋白→【石墨碳固定相萃取：去離子水水洗脫鹽→洗脫(20％乙腈水溶液，40％乙腈和0.05％三氟乙酸溶液)】→9-氨基芘-1,4,6-三磺酸三鈉鹽衍生(過夜)→毛細電泳色譜檢測。

3)單獨使用離子色譜、液相和質譜只能檢測部分母乳低聚糖。

從檢測結果看，與毛細管電泳色譜、離子色譜，以及單獨使用液相或質譜相比，液質聯用法可以檢測出較多的HMO種類，但是液質聯用檢測HMO存在以下問題：

1)樣品前處理步驟較為復雜，易導致偶然誤差增加。前處理取樣量僅為50μL，樣品在脫脂、脫蛋白后要經過還原、固相萃取、冷凍干燥、復溶等步驟。固相萃取過程中，需經過不同的洗脫液洗脫，易產生洗脫不徹底而導致樣品損失；冷凍干燥過程中或干燥后打開密封管時，由于存在真空也易導致樣品損失。由于取樣量較少，且其中的HMO含量僅為1％左右，因此易導致較大的偶然誤差。

2)質譜所用的檢測器多為飛行時間(Time of Flight,TOF)檢測器，盡管TOF應用的范圍較廣，但是并不代表最先進的質譜檢測器。

Q Exactive檢測器可以在很多方面替代TOF，很多實驗室采購了Q Exactive檢測器，但目前為止并沒有關于采用Q Exactive檢測母乳低聚糖的相關報道。

發明內容