[發明專利]膽汁和血清中熊脫氧膽酸的純化分離和LC?MS/MS檢測

在審

• 申請號: 201610554568.7
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN107621503A
• 公開（公告）日: 2018-01-23
• 發明（設計）人: 朱監寶;官培龍;郭孟磊
• 申請（專利權）人: 上?？闪γ匪镝t藥科技有限公司;上海愛可賽默醫療器械有限公司;廣州可力質譜醫療器械有限公司;江蘇可力色質醫療器械有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司31266
• 代理人: 崔佳佳,馬莉華

技術領域

本發明涉及質譜檢測領域，具體地涉及熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸高效液相色譜質譜聯用法檢測試劑盒。

背景技術

膽汁酸是肝臟中細胞色素氧化膽固醇的產物，在腸道消化吸收脂肪和機體維持膽固醇平衡上起著重要的作用。膽汁酸是膽汁中的主要成分，是人體內環境中重要的生理介質之一，主要有膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、石膽酸和熊脫氧膽酸，以及這5種游離膽汁酸對應的甘氨和?；墙Y合型膽汁酸。健康人的膽汁和外周血液中，膽汁酸譜組分相對恒定；發生膽石癥、動脈粥樣硬化、高血壓等多種疾病時，會引起人體膽汁酸代謝異常，導致血清中相應膽汁酸含量的改變。因此，通過膽汁、血清膽汁酸譜的檢測，可以了解機體膽汁酸的代謝，并有助于疾病的臨床診治。

目前，膽汁和血清中膽汁酸的檢測主要通過液相色譜質譜聯用(LC-MS/MS)的方法。質譜通過測定m/z來區別不同的化合物，因此其不能有效的區別同分異構體，然而膽汁酸成分中含有多種同分異構體，例如甘氨脫氧膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸，如何通過液相方法分離這些同分異構體至關重要。

熊脫氧膽酸作為膽汁酸的一種，其對原發性膽汁性肝硬化，囊胞性纖維癥和嬰幼兒膽道阻塞具有很好的療效。膽汁中熊脫氧膽酸豐富的含量是治療慢性膽道疾病的首要前提，因此準確的測定血清和膽汁中熊脫氧膽酸的含量具有重要的意義。對于熊脫氧膽酸而言，其存在多種同分異構體，主要有脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸和豬脫氧膽酸。

目前測定熊脫氧膽酸的LC-MS/MS方法中，對于上述四種同分異構體的檢測多多少少都存在不足，絕大多數方法中均缺乏豬脫氧膽酸的檢測，有的方法則特異性不足。由于豬脫氧膽酸和熊脫氧膽酸在結構上的相似性，使其在色譜中具有幾乎相同的保留時間，這使得檢測得到的熊脫氧膽酸的含量往往是熊脫氧膽酸和豬脫氧膽酸濃度之和，從而造成臨床診斷的假陽性升高。

本研究針對上述情況，利用高效液相色譜對包括熊脫氧膽酸在內的四種同分異構體進行的有效的分離，然后采用串聯質譜來定量，大大提高了熊脫氧膽酸在臨床檢測和診斷中的準確性。

因此，本領域迫切需要開發新的檢測靈敏度較高并且能夠同時定量檢測熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸的技術。

發明內容

本發明的目的就是提供一種檢測靈敏度較高并且能夠同時定量檢測熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸的技術。

在本發明的第一方面，提供了一種高效液相色譜質譜聯用法檢測試劑盒，其特征在于，包括：

(1)質控品，所述的質控品中含有熊脫氧膽酸和豬脫氧膽酸；

(2)同位素內標提取液，所述的同位素內標提取液包括8種同位素內標CA-d5，DCA-d5，LCA-d4，GLCA-d4，TCA-d4，TLCA-d5，TCDCA-d5，TUDCA-d5；

(3)稀釋液，所述的稀釋液為乙腈；

(4)轉化液，所述的轉化液為PTAD(4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮)；

(5)復溶液，所述的復溶液為甲醇；

(6)流動相添加劑A，所述的流動相添加劑A為飽和一元羧酸；

(7)流動相添加劑B，其中所述的流動相添加劑B為C1-C3胺化合物。

在另一優選例中，所述的C1-C3胺化合物選自下組：甲胺、乙胺、丙胺、或其組合。

在另一優選例中，所述試劑盒還包括選自下組的部件：

96孔反應板、說明書。

在另一優選例中，所述的試劑盒還包括選自下組的部件：

對照品用于建立標準曲線。

在另一優選例中，所述的流動相添加劑B為甲胺。

在另一優選例中，所述飽和一元羧酸為甲酸、乙酸、丙酸、丁酸或其組合。

在另一優選例中，所述飽和一元羧酸為甲酸。

在另一優選例中，所述飽和一元羧酸為甲醇和乙醇之一或其組合。

在另一優選例中，所述飽和一元羧酸為甲醇。

本發明的第二方面，通過串聯質譜法測定所取的生物樣品中熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸的量的方法，其包括：

(i)通過利用電噴霧離子源(ESI)對所述熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸和內標進行電離，分別產生所述熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸和所述內標的至少一種前體離子；

(ii)分別產生所述熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸和所述內標的所述前體離子的一種或多種碎片離子；和

(iii)比較步驟(i)或(ii)或兩者中產生的所述熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸和所述內標的一種或多種所述離子的量以確定所述生物樣品中的熊脫氧膽酸和或豬脫氧膽酸的量；