[發明專利]一種雜合抗菌肽突變體CAM?W融合基因及其重組表達方法

在審

• 申請號: 201610545958.8
• 申請日: 2016-07-12
• 公開（公告）號: CN107022558A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 姬生躍;李恒鑫;李偉麗;程磊;武鑫
• 申請（專利權）人: 姬生躍;李恒鑫;武鑫
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/75;C12N15/66
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明涉及一種雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因及其重組表達方法，具體涉及一種天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因及其重組表達方法。

背景技術

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一類具有抗菌活性多肽的總稱。1981年瑞典科學家Boman等從惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)蛹中誘導分離得到一種抗菌肽，并將其命名為cecropin，中文名為天蠶素。天蠶素對革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌具有很強的殺傷作用，而對真核細胞沒有毒性。天蠶素抗菌肽一般含有37～39個氨基酸殘基，半胱氨酸含量低，其N端區域具有強堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結構，而在C端區域可形成疏水螺旋，且兩者之間由甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區，多數多肽的C端被酰胺化，而酰胺化對其抗菌活性具有重要作用。

蜂毒素(melittin)是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香氣味的透明毒液(蜂毒)的重要組成部分，占蜂毒干重的50％以上，由26個氨基酸組成，相對分子質量2984，不含二硫鍵，是蜂毒中的主要活性物質，具有抗菌、抗輻射和非常顯著的抗炎鎮痛作用。蜂毒素能夠抑制20～30種革蘭氏陰性及革蘭氏陽性病原微生物的發育，并能對抗對青霉素有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒素是迄今為止人類所知的抗炎活性最強的物質之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍。由于許多疼痛是炎癥導致的，因此蜂毒素在治療關節炎、痛風等炎性疼痛方面，具有顯著的成效。近年來的研究表明，蜂毒素還具有抑制腫瘤生長的作用，從而進一步拓寬了蜂毒素的應用范圍。

目前，由于抗菌肽的組成特點是由氨基酸組成，基本不含外源成分及化學修飾，不需要翻譯后加工修飾。因此，抗菌肽可以采取原核表達系統進行表達，但由于抗菌肽本身對宿主細胞也有一定的傷害作用，同時分子量較小的小肽也不能直接進行表達，需要借助融合蛋白來適時封閉抗菌肽的毒性。而融合蛋白的合成，迄今為止，主要使用大腸桿菌和酵母菌作為重組技術工業規模生產蛋白質的宿主菌細胞，由于大腸桿菌表達系統所表達的目的蛋白一般存在于細胞內并且容易形成包涵體，這就導致獲得目的蛋白的后處理工藝比較復雜、成本也會比較高。酵母菌表達系統生物合成外源蛋白周期較長，導致其生產外源蛋白的成本也較高。但是，枯草芽孢桿菌表達系統合成目的蛋白的周期短、可以把目的蛋白分泌到細胞外并且不易生成包涵體，是一個比較理想的表達系統；而且枯草芽孢桿菌WB700為7種蛋白酶缺陷型菌株，可以在很大程度上降低分泌到細胞外的目的蛋白降解，提高目的蛋白的產率。利用定點突變技術突變特殊位點氨基酸產生的突變體EDDIE，能避免體內剪切，在體外能夠增加蛋白質的溶解性，并能夠準確剪切和快速折疊，這個突變蛋白被命名為EDDIE。EDDIE蛋白來源于N^pro蛋白，N^pro蛋白是豬瘟病毒外殼蛋白的一部分，由168個氨基酸組成，它能將聯在其C端的蛋白質準確地剪切下來，而形成具有原始N端的蛋白質；它還能在原核細菌中高效表達，其由高度疏水氨基酸組成，易形成包涵體；同時原始自我剪切蛋白N^pro在細胞內也有部分自我剪切的功能，用它表達抗菌肽時會對宿主細胞產生毒害作用。天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W是近年來在天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽CAM的基礎上經定點突變而來，具有高效殺菌活性和低細胞毒性，同時具有很好的生物學穩定性。耐高溫、耐酶解、酸堿耐受范圍也較廣，是一種綜合表現比較優良的、在生物醫藥、食品防腐、畜牧業安全生產等領域有著廣泛應用前景的抗菌肽。因此，如若能以枯草芽孢桿菌WB700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的基因與突變體EDDIE的基因融合，合成新的融合蛋白來封閉抗菌肽的毒性，必將產生良好的社會效益和經濟效益。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因及其重組表達方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是，一種雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因，以pGJ222為表達載體，以枯草芽孢桿菌WB700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的基因與豬瘟病毒外殼蛋白突變體EDDIE的基因融合，合成編碼EDD用-CAM-W融合基因的重組表達，所述EDDIE-CAM-W融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

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