[發明專利]一種雜合抗菌肽突變體CAM?W融合基因及其重組表達方法

在審

• 申請號: 201610545958.8
• 申請日: 2016-07-12
• 公開（公告）號: CN107022558A
• 公開（公告）日: 2017-08-08
• 發明（設計）人: 姬生躍;李恒鑫;李偉麗;程磊;武鑫
• 申請（專利權）人: 姬生躍;李恒鑫;武鑫
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C12N15/75;C12N15/66
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因，其特征在于，以pGJ222為表達載體，以枯草芽孢桿菌WB700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的基因與豬瘟病毒外殼蛋白突變體EDDIE的基因融合，合成編碼EDDIE-CAM-W融合基因的重組表達，所述EDDIE-CAM-W融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因，其特征在于，所述編碼EDDIE-CAM-W融合基因的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一種如權利要求1或2所述的雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因的重組表達方法，其特征在于，是以pGJ222為表達載體，以枯草芽孢桿菌WB700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的基因與豬瘟病毒外殼蛋白突變體EDDIE的基因融合，合成編碼EDDIE-CAM-W融合基因的重組表達。

4.根據權利要求3所述的雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因的重組表達方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的基因與豬瘟病毒定點突變外殼蛋白EDDIE和果聚糖蔗糖酶信號肽SacB基因融合，合成編碼SacB-EDDIE-CAM-W融合蛋白的融合基因；

(2)用限制性內切酶EcoRI和SacI對SacB-EDDIE-CAM-W融合蛋白的基因進行雙酶切，并與用同樣限制性內切酶雙酶切的表達載體pGJ222質粒連接，構建出自我裂解釋放出有生物學活性抗菌肽蛋白的表達載體pDM031；

(3)將大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質粒pDM031轉化至大腸桿菌DH5α菌株，獲得重組大腸桿菌EWD31菌株，并擴增質粒pDM031；

(4)將在大腸桿菌DH5α菌株中擴增后的pDM031轉化至枯草芽孢桿菌WB700菌株，獲得可以向胞外表達EDDIE-CAM-W融合蛋白的重組枯草芽孢桿菌BWD31菌株；

(5)通過在液體培養基中培養重組枯草芽孢桿菌BWD31菌株并使用5％麥芽糖誘導，獲得分泌到細胞外的EDDIE-CAM-W融合蛋白。

5.根據權利要求4所述的雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因的重組表達方法，其特征在于，步驟(1)中，在EDDIE的DNA序列N-末端連上親和層析純化的SacB的DNA序列，在其C-末端連上CAM-W的DNA序列，并在整個融合DNA序列的5’端和3’端分別加上EcoRI和SacI酶切位點及相應保護堿基。

6.根據權利要求4或5所述的雜合抗菌肽突變體CAM-W融合基因的重組表達方法，其特征在于，步驟(5)中，將重組枯草芽孢桿菌BWD31菌株在固體培養基上的單克隆子，接種到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壯觀霉素的LB液體培養基中，在37℃、225rpm/min條件下培養10～12h；然后以5％的比例轉接到上述含雙抗培養基中，在30℃、200rpm/min條件下培養至菌液OD值到1.5～2.0之間，5％麥芽糖誘導12～24h；收集、離心并過濾菌液；通過EDDIE蛋白的自切割功能，即可獲得天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體CAM-W的粗蛋白液。