[發明專利]一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201610538746.7
• 申請日: 2016-07-10
• 公開（公告）號: CN107586337B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 張王剛;崔鶴;蒙昕;古流芳;高潔;劉宇宏
• 申請（專利權）人: 西安交通大學第二附屬醫院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

本發明提供了一種采用淋巴細胞雜交瘤技術制備小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的方法，這個抗體為今后檢測人KIAA0100蛋白的表達，研究人KIAA0100蛋白的結構和功能奠定了基礎。我們使用本發明中所制備的抗體，采用western blot分析方法檢測了U937細胞中人KIAA0100蛋白的表達；采用免疫細胞化學分析方法在世界上首次明確了人KIAA0100蛋白在U937細胞中的亞細胞定位。結果顯示：人KIAA0100基因在U937細胞中有兩個分子量分別為254kDa和＜250kDa的蛋白產物；在一些U937細胞中,人KIAA0100蛋白主要定位在細胞膜上，在另一些U937細胞中,人KIAA0100蛋白定位在細胞膜和細胞質。綜上所述，本發明制備的小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體能夠高效、特異地識別人KIAA0100蛋白。

技術領域

本發明涉及一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法。

背景技術

使用淋巴細胞雜交瘤技術來制備單克隆抗體技術是由Milstein和Kohler在1975年首先創立的，目前采用該技術制備的單克隆抗體已經被廣泛地應用于生物學和疾病的診斷和治療等領域。單克隆抗體可以用來檢測抗原蛋白的表達，分析抗原蛋白的結構、檢測抗原抗體之間的結構關系等。

淋巴細胞雜交瘤技術的基本原理是將骨髓瘤細胞和經抗原誘導產生的能分泌特定抗體的B細胞利用聚乙二醇等細胞融合劑(或者電融合、激光融合)在體外進行細胞融合，篩選并建立能穩定分泌特定單克隆抗體的雜交瘤細胞株。這樣制備出的雜交瘤細胞同時具有兩種親本細胞的特性，即腫瘤細胞的無限增殖能力及淋巴細胞分泌特異性抗體的能力。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有純度高、效價高、均質性好、重復性好、便于大量生產和進行質量控制等明顯優勢。

人KIAA0100基因是KIAA基因家族的一員，KIAA基因家族是由Kazusa基因研究中心主要從急性髓系白血病細胞系KG-1cDNA文庫中獲得的一大類編碼大蛋白的基因。目前，人KIAA0100基因的功能尚未明確。因為缺乏高效、特異的抗體，無法進行人KIAA0100蛋白表達的研究，無法明確人KIAA0100蛋白的亞細胞定位，也阻礙了其生物學功能的研究。

發明內容

針對上述存在的問題，本發明提供了一種采用淋巴細胞雜交瘤技術制備高效、特異的小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的方法,為檢測KIAA0100蛋白的表達，研究KIAA0100蛋白的結構和功能奠定基礎。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

步驟(1)：使用生物信息學軟件Optimum^TMCodon(http://www.genscript.com/codon_opt.html)對人KIAA0100蛋白的蛋白片段(1557-2234)進行分析，將其對應的核苷酸序列中的大腸桿菌稀有密碼子進行優化，在優化后的核苷酸序列的3′端加上6×組氨酸(histidine，His)標簽，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a載體中，構建pET30a-KIAA0100(1557-2234)質粒表達載體；

步驟(2)：pET30a-KIAA0100(1557-2234)質粒在大腸桿菌中經誘導表達，獲得重組人KIAA0100蛋白片段(1557-2234)后,使用Ni²⁺-IDA親和層析柱純化；