[發明專利]一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201610538746.7
• 申請日: 2016-07-10
• 公開（公告）號: CN107586337B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 張王剛;崔鶴;蒙昕;古流芳;高潔;劉宇宏
• 申請（專利權）人: 西安交通大學第二附屬醫院
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 李宏偉

1.一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)：使用生物信息學軟件Optimum^TMCodon對人KIAA0100蛋白的蛋白片段1557-2234進行分析，將其對應的核苷酸序列中的大腸桿菌稀有密碼子進行優化，在優化后的核苷酸序列的3 ′端加上6×組氨酸標簽，人工合成核苷酸序列，克隆入pET30a載體中，構建pET30a-KIAA0100 1557-2234質粒表達載體；

步驟(2)：pET30a-KIAA0100 1557-2234質粒在大腸桿菌中經誘導表達，獲得重組人KIAA0100蛋白片段1557-2234后,使用鎳離子-亞氨基二乙酸親和層析柱純化；

步驟(3)：使用經濃縮和復性后的重組人KIAA0100蛋白片段1557-2234作為免疫原免疫5只健康BALB/c小鼠，取成功免疫后的小鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，制備雜交瘤細胞株，以未免疫的、健康BALB/c小鼠的血清作為陰性對照，使用間接酶聯免疫吸附法篩選雜交瘤細胞株，使用有限稀釋法對篩選出的陽性雜交瘤細胞株進行2輪亞克隆，將ELISA檢測陽性的雜交瘤細胞進行擴大培養，最終得到一個穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

步驟(4)：使用SBA小鼠單克隆抗體分析試劑盒檢測獲得的小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的亞型，使用western blot分析和免疫細胞化學分析對獲得的小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體進行鑒定；

步驟(5)：選擇3只健康BALB/c雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射0 .5ml的姥鮫烷，14天后，腹腔注射雜交瘤細胞，在注射前1天使用新鮮培養基對處于對數生長期的雜交瘤細胞進行換液，注射當天，混勻雜交瘤細胞制成細胞懸液，計數后，將細胞懸液加入15ml離心管中，室溫200×g離心5分鐘，棄上清后用磷酸鹽緩沖液懸浮細胞，使細胞濃度為5×10⁶個/ml，每只小鼠注射1ml；觀察小鼠的健康狀況及腹水產生情況，10天－14天后收集腹水，收集的腹水使用蛋白A親和層析柱純化；

重組人KIAA0100蛋白片段1557-2234抗原的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

密碼子優化后的編碼該重組蛋白片段的核苷酸序列為SEQ ID NO:2；

pET30a-KIAA0100 1557-2234 表達載體在大腸桿菌BL21中經異丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達，使用Ni²⁺-IDA親和層析柱對獲得的重組人KIAA0100蛋白片段1557-2234進行純化；

所述步驟(4)中使用western blot分析對獲得的小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體進行鑒定的方法為：將U937細胞總蛋白經SDS-PAGE分離后轉移至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體一抗，以辣根過氧化物酶標記的山羊抗小IgG為二抗，使用westernblot方法檢測。

2.根據權利要求1所述的一種小鼠抗人KIAA0100蛋白單克隆抗體的制備方法，其特征在于：pET30a-KIAA0100 1557-2234 重組質粒轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，使用含卡那霉素的LB固體培養基篩選陽性克隆，并進行PCR驗證，提取陽性克隆質粒后進行酶切和測序鑒定。