[發明專利]一種紅外線?固定化酶協同酶解蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201610537865.0
• 申請日: 2016-07-08
• 公開（公告）號: CN107586816A
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 王玉霞;馬光輝;賴恩平;周煒清;韋祎
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N11/08
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司11332
• 代理人: 鞏克棟,侯桂麗

技術領域

本發明涉及屬于生物化工領域，具體涉及一種蛋白質酶解方法，尤其涉及一種紅外線-固定化酶協同酶解蛋白質的方法。

背景技術

蛋白質組學是一門后基因組學時代興起的學科，它本質上是從蛋白質水平上對基因和細胞進行大規模直觀的鑒定，其廣泛應用于癌癥的識別與治療、疾病的預測等。蛋白質的酶解是蛋白質組學研究中蛋白質分析鑒定的關鍵步驟。傳統的酶解過程是基于溶液酶解法，通常是將自由酶與待測樣品以質量比1:50的比例混合后，在37℃下反應12-24h。這種方法存在酶解時間較長、容易產生酶的自身酶解、酶無法回收利用等問題。為了克服這些缺點，科學家對酶解方法進行了大量的研究。

目前，提高酶解效率的方法主要是采用物理化學方法和固定化酶技術對酶解過程進行促進。常用的物理化學方法包括超聲波、微波、紅外線等。作為一種重要的電磁波形式，紅外輻射最為廣泛的應用在于提供加熱源。最近，采用紅外線輔助自由酶酶解蛋白的工作已有報道。相對于傳統的水浴加熱法而言，使用紅外線除了可以提供熱量來源，更重要的是紅外線能夠激發分子內的振動，從而促使蛋白質酶切位點的暴露，提高酶解效率。然而，紅外線在輔助酶解的過程中，由于其持續激發分子振動，會使被輻射的物體產生熱量。當溫度過高時，會導致酶失活，影響酶解效果。因此，在使用紅外線輔助自由酶酶解時，需要采用外源制冷裝置對反應體系的溫度進行控制。這大大增加了裝置的復雜程度，且浪費了能源。

固定化酶技術是將蛋白水解酶固定在載體材料上，在一定溫度下與蛋白質溶液進行酶解反應，該技術通過增加酶分子結構的剛性從而顯著提高酶的耐熱性。但酶分子被固定后，移動性變差，同時載體在酶與待測蛋白質樣品之間形成的空間位阻也限制了酶與底物的接觸。因此，若能在酶解過程中，將待測蛋白質樣品富集于固定化酶周圍，并且提高酶與待測蛋白質樣品酶切位點的接觸頻率，則能極大程度加速酶解反應，縮短酶解時間。考慮到紅外線輔助酶解的優異效果，以及固定化酶技術的優勢，若能將兩種技術結合起來，且不采用冷卻裝置，則能為蛋白質酶解提供一種新型的快速高效方法。

發明內容

鑒于現有技術中存在的上述問題，本發明提供了一種紅外線-固定化酶協同酶解蛋白質的方法，本發明利用溫敏性微球為固定化酶載體，將紅外線技術與溫敏固定化酶相結合對蛋白質進行協同酶解處理，且在酶解過程中不需要任何外源加熱和降溫設備。本發明步驟簡單、操作方便，利用紅外線對反應體系進行升溫并促進蛋白酶切位點的暴露，可有效增加酶切位點與酶的作用頻率，從而顯著提高酶解效率；同時，在體系升溫過程中，溫敏固定化酶微球吸收體系熱量并發生相轉變，表現出疏水性質。疏水的微球能有效保持酶活性，并通過疏水相互作用富集待測蛋白質樣品，增加酶與底物的接觸幾率。這種紅外線與固定化酶協同酶解作用，可以更好地實現蛋白質的高效酶解，有助于批量蛋白質的高通量酶解和鑒定。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了一種蛋白質酶解的方法，其包括：在紅外線輻射下利用溫敏固定化酶微球對蛋白質進行酶解。

本發明是以溫敏性微球為固定化酶載體，通過紅外線輻射來調節溫敏固定化酶微球的親疏水性質，進而控制蛋白質酶解過程。

本發明采用將紅外線-溫敏固定化酶微球相結合用于蛋白質酶解，即本發明提供了關于紅外線-溫敏固定化酶微球相結合在蛋白質酶解中的用途。

本發明利用紅外線輻射調節溫敏固定化酶微球親疏水性的原理為：在紅外線輻射下，當溫度高于溫敏固定化酶微球的臨界相轉變溫度時，微球呈疏水性，能夠富集待測蛋白質樣品的同時對其進行酶解，在溫度低于溫敏固定化酶微球的臨界相轉變溫度時，停止酶解并釋放肽段，從而提高酶解效率和樣品肽段的檢出率。

本發明采用溫敏性微球，相比納米級別載體，其具有更快的沉降速率，無需使用納米載體體系在分離過程中所要求的高轉速、長時間等苛刻的分離條件，可避免由于長時間離心時，離心機發熱對固定化酶活性的影響；相比采用其它載體，例如磁性顆粒、聚合物膜、介孔材料、二氧化硅、氧化石墨烯材料等，其可以實現通過溫度來調節溫敏固定化酶微球的親疏水性質，從而大大提高酶解的效率以及后續蛋白質鑒定的準確度，提高樣品肽段的檢出率。

本發明采用紅外線技術，在酶解過程不需要任何外源加熱和降溫設備，充分利用了紅外線對反應體系進行升溫并促進蛋白酶切位點的暴露，其與溫敏固化酶微球二者具有協同增效作用，從而實現了蛋白質的高效酶解，有助于批量蛋白質的高通量酶解和鑒定。

根據本發明，所述蛋白質酶解的方法，其包括以下步驟：

(1)將待酶解的蛋白質樣品進行熱變性處理；