[發(fā)明專利]替度魯肽串聯(lián)多肽及替度魯肽制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610537328.6
• 申請日: 2016-07-08
• 公開（公告）號: CN107586330B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許俊;路建光;黃宗慶;姜旖旎;郭新昆
• 申請（專利權(quán)）人: 上海多米瑞生物技術(shù)有限公司;上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/26;A61P1/00
• 代理公司: 上海衡方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31234
• 代理人: 卞孜真;周世亮

1.一種替度魯肽串聯(lián)多肽，其特征在于，所述替度魯肽串聯(lián)多肽包含兩個或更多個替度魯肽多肽通過接頭肽連接而成，在接頭處包含酸切和酶切位點；所述替度魯肽串聯(lián)多肽的氨基酸序列為MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，所述n＝1，4或者9；

所述酸切位點是天冬氨酸-脯氨酸連接D-P鍵；所述酶切位點是DDDDK。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的替度魯肽串聯(lián)多肽，其特征在于，所述替度魯肽串聯(lián)多肽的氨基酸組成結(jié)構(gòu)通式為：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1，4或者9。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的替度魯肽串聯(lián)多肽，其特征在于，所述酸切位點是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸進(jìn)行酸切的位點。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的替度魯肽串聯(lián)多肽，其特征在于，所述酶切位點是使用腸激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶進(jìn)行酶切的位點。

5.一種包含表達(dá)如權(quán)利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯(lián)多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體是在大腸桿菌中表達(dá)的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體是pET28a。

8.一種包含如權(quán)利要求5-7中任一項所述的表達(dá)載體的大腸桿菌。

9.一種使用表達(dá)如權(quán)利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯(lián)多肽的核苷酸序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)替度魯肽串聯(lián)多肽的方法。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌是BL21。

12.一種使用如權(quán)利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯(lián)多肽制備替度魯肽的方法，所述方法包括：

構(gòu)建包含如權(quán)利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯(lián)多肽序列的表達(dá)載體；

將所述表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌，所述表達(dá)載體是在大腸桿菌中表達(dá)的載體；

將所得的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行酸切和酶切處理，其中所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸；所述酶切是使用腸激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶進(jìn)行；

分離純化以獲得替度魯肽，通過HPLC進(jìn)行分離。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述酸切是使用50％醋酸/HCl進(jìn)行；所述酶切是使用腸激酶進(jìn)行。

14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)將菌體加入含或不含Triton X-100的水溶液，通過加熱使表達(dá)產(chǎn)物釋放出來；(b)采用沉淀的方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行粗分離，粗分離產(chǎn)品為沉淀；(c)粗分離產(chǎn)品經(jīng)過先高溫酸切，去除酸溶液，用酶切反應(yīng)緩沖液溶解后加腸激酶酶切；或先用腸激酶酶切，去除酶切反應(yīng)緩沖液后高溫酸切獲得替度魯肽粗品；(d)替度魯肽粗品上樣于反相層析介質(zhì)，用含TFA的乙腈溶液洗脫，采用色譜分析，收集并合并含替度魯肽的洗脫液；(e)取上述步驟中的合并的洗脫液，去除TFA和/或有機(jī)溶劑；(f)干燥，即得替度魯肽。