[發明專利]替度魯肽串聯多肽及替度魯肽制備方法

有效

• 申請號: 201610537328.6
• 申請日: 2016-07-08
• 公開（公告）號: CN107586330B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 許俊;路建光;黃宗慶;姜旖旎;郭新昆
• 申請（專利權）人: 上海多米瑞生物技術有限公司;上海醫藥工業研究院
• 主分類號: C07K14/605
• 分類號: C07K14/605;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/26;A61P1/00
• 代理公司: 上海衡方知識產權代理有限公司 31234
• 代理人: 卞孜真;周世亮

1.一種替度魯肽串聯多肽，其特征在于，所述替度魯肽串聯多肽包含兩個或更多個替度魯肽多肽通過接頭肽連接而成，在接頭處包含酸切和酶切位點；所述替度魯肽串聯多肽的氨基酸序列為MGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(PGTDDDDKHGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD)_n，所述n＝1，4或者9；

所述酸切位點是天冬氨酸-脯氨酸連接D-P鍵；所述酶切位點是DDDDK。

2.根據權利要求1所述的替度魯肽串聯多肽，其特征在于，所述替度魯肽串聯多肽的氨基酸組成結構通式為：C₁₉₇H₃₀₇N₅₀O₇₂S₂(C₁₉₇H₃₀₅N₅₀O₇₂S₁)_n，其中n＝1，4或者9。

3.根據權利要求1所述的替度魯肽串聯多肽，其特征在于，所述酸切位點是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸進行酸切的位點。

4.根據權利要求1所述的替度魯肽串聯多肽，其特征在于，所述酶切位點是使用腸激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶進行酶切的位點。

5.一種包含表達如權利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯多肽的核苷酸序列的表達載體。

6.根據權利要求5所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體是在大腸桿菌中表達的載體。

7.根據權利要求6所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體是pET28a。

8.一種包含如權利要求5-7中任一項所述的表達載體的大腸桿菌。

9.一種使用表達如權利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯多肽的核苷酸序列在宿主細胞中表達替度魯肽串聯多肽的方法。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是大腸桿菌。

11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌是BL21。

12.一種使用如權利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯多肽制備替度魯肽的方法，所述方法包括：

構建包含如權利要求1-4中任一項所述的替度魯肽串聯多肽序列的表達載體；

將所述表達載體在宿主細胞中表達，所述宿主細胞是大腸桿菌，所述表達載體是在大腸桿菌中表達的載體；

將所得的表達產物進行酸切和酶切處理，其中所述酸切是使用HCl、H₂SO₄、H₃PO₄、醋酸、甲酸、三氟乙酸、醋酸/HCl、醋酸/H₂SO₄、醋酸/H₃PO₄、醋酸/甲酸、或醋酸/三氟乙酸；所述酶切是使用腸激酶、木瓜蛋白酶、Xa因子、凝血酶進行；

分離純化以獲得替度魯肽，通過HPLC進行分離。

13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述酸切是使用50％醋酸/HCl進行；所述酶切是使用腸激酶進行。

14.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)將菌體加入含或不含Triton X-100的水溶液，通過加熱使表達產物釋放出來；(b)采用沉淀的方法對表達產物進行粗分離，粗分離產品為沉淀；(c)粗分離產品經過先高溫酸切，去除酸溶液，用酶切反應緩沖液溶解后加腸激酶酶切；或先用腸激酶酶切，去除酶切反應緩沖液后高溫酸切獲得替度魯肽粗品；(d)替度魯肽粗品上樣于反相層析介質，用含TFA的乙腈溶液洗脫，采用色譜分析，收集并合并含替度魯肽的洗脫液；(e)取上述步驟中的合并的洗脫液，去除TFA和/或有機溶劑；(f)干燥，即得替度魯肽。