[發(fā)明專利]一種高精氨酸混合肽的制備方法及其在肝癌治療中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610520587.8
• 申請日: 2016-07-05
• 公開（公告）號: CN107574210B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳棟梁;張陽;劉立堅;何立蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 陳棟梁;新生肽生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/20;C07K1/14;A61K38/01;A61P35/00;A23L33/18;A23L33/175
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1.一種高精氨酸混合肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

(1)：將經(jīng)脫脂粉碎的核桃粕、雞蛋清蛋白與水混勻，攪拌后超高壓預(yù)處理，隨后超聲波-微波輔助酶解，酶解結(jié)束后升溫滅酶，板框壓濾收集清液；其中所述超聲波-微波輔助酶解包括：在經(jīng)超高壓預(yù)處理的混懸液加入混懸液質(zhì)量2％～5％的堿性蛋白酶并攪拌均勻，同時超聲波-微波輔助酶解，酶解后經(jīng)調(diào)pH至6-8，并加入混懸液質(zhì)量2％～5％的木瓜蛋白酶并攪拌均勻，同時超聲波-微波輔助酶解；

(2)：清液凍干后，利用反相高效液相色譜法對凍干粗粉中的目標肽段進行分離，采用4.6×250mm，5μm，238EV54的Everest C18作為反相柱，乙腈水溶液作為流動相，三氟乙酸作為陰離子對試劑，檢測波長214nm，上樣前純乙腈沖洗色譜柱，流動相溶解25mg凍干粉定容至25mL，0.45μm微孔濾膜過濾，進樣體積20μL，柱溫30℃，分離條件為乙腈濃度18％v/v，三氟乙酸濃度0.09％v/v，流速1.0mL/min，保留時間為9.64min、11.36min、13.80min，收集三個洗脫組分，凍干后即為高精氨酸混合肽粉；

(3)：用體積比3:1的濃硫酸和30％雙氧水的piranha溶液浸沒蓋玻片和載玻片，超聲清洗1.5～2.5h后，純水洗凈，氮氣吹干待用；將洗凈的蓋玻片浸泡于高精氨酸混合肽水溶液中以獲得混合肽固定化模板；將洗凈的載玻片浸泡于0.5～1.5％v/v 3-氨丙基三乙氧基硅烷的甲醇溶液中，20～40rpm振蕩15～45min后，甲醇漂洗晾干，獲得硅烷化載玻片；將功能單體丙烯酸、甲基丙烯酸，交聯(lián)劑三乙二醇二甲基丙烯酸酯混勻，加入光引發(fā)劑異丙基硫雜蒽酮獲得預(yù)聚混合液；向預(yù)聚混合液中通入氮氣后將其平鋪于硅烷化載玻片表面，載玻片經(jīng)旋轉(zhuǎn)后將混合肽固定化模板覆于其上，紫外光引發(fā)聚合完成后，將玻片浸泡于8～12％m/v SDS:8～12％v/v HAc溶液中，揭去蓋玻片，80～160rpm振蕩4～8h后，純水振蕩漂洗至中性，獲得高精氨酸混合肽表面印跡膜；

(4)：將步驟(3)獲得的高精氨酸混合肽表面印跡膜浸沒于步驟(1)獲得的清液中，20～40rpm振蕩1～6h后取出吸附了目標肽的印跡膜，浸沒于0.6～1.2mol/L NaCl溶液中，同時100～300W超聲10～50min輔助洗脫；收集洗脫液，通過陽離子交換樹脂去除NaCl，透過液經(jīng)低溫噴霧干燥獲得高精氨酸混合肽粉末；洗脫后的表面印跡膜經(jīng)純水漂洗，再次浸沒于步驟(1)獲得的新的清液中，重復(fù)后續(xù)步驟，用于分離高精氨酸混合肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高精氨酸混合肽的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，將經(jīng)脫脂粉碎的核桃粕與雞蛋清蛋白按質(zhì)量比3～5:1混合，將此蛋白粕混合物與水按質(zhì)量體積比1:4～12混勻，室溫攪拌1.5～2.5h后置于超高壓主機系統(tǒng)中，處理壓力200～600MPa，保壓時間10～30min，獲得經(jīng)超高壓預(yù)處理的混懸液；將混懸液控溫至40～60℃，調(diào)pH至9～10，加入混懸液質(zhì)量2％～5％的堿性蛋白酶并攪拌均勻，同時超聲波-微波輔助酶解，超聲功率200～400W，超聲時間10～20min，微波功率200～600W，微波時間5～15min，酶解1.5～2.5h后調(diào)pH至6～8，加入混懸液質(zhì)量2％～5％的木瓜蛋白酶并攪拌均勻，同時超聲波-微波輔助酶解，超聲功率200～400W，超聲時間10～20min，微波功率200～600W，微波時間5～15min，酶解2～3h后升溫滅酶，板框壓濾后收集清液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將洗凈的蓋玻片浸泡于2～8g/L高精氨酸混合肽水溶液中，20～40rpm振蕩4～8h后，純水漂洗晾干，獲得混合肽固定化模板。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，將功能單體丙烯酸、甲基丙烯酸，交聯(lián)劑三乙二醇二甲基丙烯酸酯按體積比1～3:0.5～1.5:4.5～9混勻，加入0.2～0.8體積1～4mmol/L的異丙基硫雜蒽酮的丙酮溶液作為光引發(fā)劑，獲得預(yù)聚混合液。