[發明專利]生物補片的制備方法

有效

• 申請號: 201610511579.7
• 申請日: 2016-07-04
• 公開（公告）號: CN105963787B
• 公開（公告）日: 2018-02-27
• 發明（設計）人: 史真;史偉云
• 申請（專利權）人: 拜歐迪賽爾（北京）生物科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/50
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于組織工程技術領域，具體為新型的肌腱和小腸漿膜組織補片的制備方法。

背景技術

神經、膀胱、血管、肌腱、腹壁及眼的結膜等組織缺損的修復中最大的難題是修復材料。目前國內外用外科補片的材料絕大部分是合成材料，如聚丙烯補片(PP)和聚酯補片(PE)等。其最大的缺陷是抗感染率低，組織相容性差，及物理刺激引起的無菌炎癥和慢性排異引起的后遺癥，甚至造成修補的器官發生感染和與周圍組織發生粘連。近幾年發展的半吸收復合材料，如聚羥基乙酸(PGA)和聚乳酸(PLA)等，常因降解過快導致失去療效。而使用合成材料和復合材料可能導致諸多臨床并發癥，均不是理想的組織修補材料。隨著生物材料的出現——尋找具有良好組織屏障作用和抗感染能力強的低細胞毒性、低抗原性的生物材料應用于臨床迫在眉睫。

肌腱和小腸的漿膜是一種天然的細胞外基質生物材料，主要由I、III型纖維膠原蛋白構成，并具有彈性結締組織復雜的成分結構，是理想的生物支架材料。另外，小腸的漿膜中還含有多種生長因子，即使經過脫細胞處理后依然保留，這些生長因子在組織的修復和重構中有著重要的促進作用，優于目前臨床應用的其它細胞外基質材料和人工聚合物。

國外已經有多種商品化的小腸脫細胞產品，如Surgisis，Restore等產品；在我國也有相關專利如“脫細胞小腸粘膜下層生物材料”(申請號200810150792.5)和“一種脫細胞生物補片及其制備方法和裝置”(申請號201310117569.1)等，這些產品的問題在于脫細胞方法不完善，例如處理方法僅使用低濃度過氧乙酸處理，細胞殘留較多，脫細胞效果欠佳，使用中會引發機體的免疫排斥反應；或加用乙醇等進行脫細胞；或應用長時間浸泡；或采用超聲、反復凍融、核酸酶進行脫細胞處理，這些處理造成被脫組織結構和蛋白質活性破壞，使得脫細胞肌腱和小腸組織材料內所包含的生長因子不能發揮作用。

因此針對現有技術的不足，本發明采用高靜壓技術聯合少量的酶和去垢劑脫除細胞核，并全程應用保護液進行保護的方法，提供了兩種既降低了組織的免疫原性，又保留了其正常膠原結構的優質生物補片。

發明內容

本發明提供了一種快速、全程使用特殊保護液以及適宜高效的物理聯合復合生物酶制備肌腱和小腸漿膜的脫細胞支架以用作生物補片的方法。

本發明的創新處在于：1、肌腱和小腸漿膜的脫細胞過程中全程使用一種肌腱和小腸漿膜結構的保護液；2、采用高靜壓技術預分離肌腱和小腸漿膜組織內的細胞；3、采用復合核酸酶方法消化殘余細胞核；4、利用去垢劑脫除松散破碎細胞片；5、使用保護液進行漂洗。脫細胞步驟設定合適的溫度、時間以及去垢劑、消化酶濃度對肌腱和小腸漿膜組織進行處理。

保護液的成分為：DMEM細胞培養基粉末5-10g/L、L-組氨酸鹽酸鹽2.87-3.83g/L、硫酸軟骨素25-30g/L、低分子右旋糖酐20-35g/L、羥丙基甲基纖維素2-8g/L、別嘌呤醇0.5-0.8g/L、 HEPES緩沖液20-25ml/L、鹽酸地塞米松1-2mg/L、還原型谷胱苷肽1.5-3g/L以及左氧氟沙星0.1-0.2g/L。

調節保護液的ph值為7.2-8.0，滲透壓為300-400mOsm/kgH2O。

高靜壓壓力條件為200-400MP，高靜壓頻率為2-5次，每次為1-2分鐘。

DNA酶的濃度為100-10000U/ml，核酸酶的濃度為100-10000U/ml。DNA酶或核酸酶的脫細胞核時間為1-4小時，處理溫度為15-30度。

去垢劑條件濃度為0.5-8％的TritonX-100，去垢劑使用時間為1-4小時。

可選擇性的同時或分開進行酶和去垢劑的處理。

在保護液中漂洗0.5-4小時。

將制備的肌腱和小腸漿膜補片貼附在硝酸纖維素膜上，放入無水氯化鈣分子篩內脫水，經裝袋密封并標記，后經鈷60照射滅菌，以4℃保存備用；

在臨床使用前將保存的肌腱和小腸漿膜補片放入4000u的妥布霉素生理鹽水溶液浸泡10 分鐘。

附圖說明

圖1為小腸的結構說明圖，最下層為本發明所采用的小腸漿膜

圖2為正常兔小腸的切片HE染色，最上層為漿膜層

圖3為兔小腸漿膜脫細胞切片DAPI染色

圖4為正常豬肌腱切片HE染色

圖5為脫細胞豬肌腱切片HE染色

具體實施方式