[發(fā)明專利]可誘導(dǎo)型siRNA表達(dá)載體及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610506634.3
• 申請日: 2016-06-30
• 公開（公告）號: CN107557363B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳立剛;尚仁福
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;C12N7/01
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 馬莉華;劉妍珺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及可誘導(dǎo)型siRNA表達(dá)載體及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中由雙鏈小RNA分子(small interfering RNA，siRNA)介導(dǎo)的RNA降解現(xiàn)象。RNAi最初在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)，此后在果蠅、擬南芥、斑馬魚和哺乳動物等多種真核生物中發(fā)現(xiàn)RNAi都是高度保守的。由于RNAi可以被用來特異性關(guān)閉靶基因的表達(dá)，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。因此，自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，RNAi多次入選Science雜志評出的年度十大科學(xué)進(jìn)展，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。2006年，Craig Mello和Andrew Fire因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象而被授予諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。目前大量生物技術(shù)公司和國際大制藥企業(yè)投資進(jìn)入RNAi技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域，其中針對呼吸道合胞體病毒感染(Respiratory syncytial virus infection)以及濕性年齡相關(guān)性黃斑變性病癥(Wet age-related macular degeneration)等幾種疾病的RNAi治療已進(jìn)入二期和三期臨床試驗(yàn)。另外針對乙型肝炎(Hepatitis B)、實(shí)體瘤(solid tumors)以及先天性厚甲癥(Pachyonychiacongenita)等疾病的RNAi藥物也已進(jìn)入一期或二期臨床試驗(yàn)。

RNAi中的關(guān)鍵功能分子是長度約為21個(gè)核苷酸的siRNA，最初應(yīng)用時(shí)主要依靠化學(xué)方法合成，這種方法獲得的siRNA雖然能有效抑制目的基因的表達(dá)，但容易被細(xì)胞代謝清除，作用持續(xù)時(shí)間較短，且合成成本較高，每毫克siRNA的化學(xué)合成成本需要上千元。為長期穩(wěn)定表達(dá)siRNA，研究人員設(shè)計(jì)開發(fā)出了由細(xì)胞內(nèi)自身的RNA聚合酶Ⅲ(RNA polymeraseⅢ)啟動子，如H1，U6等轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的siRNA表達(dá)載體。其中目前應(yīng)用最廣的是shRNA(short hairpin RNA)，雖然這些基于RNA聚合酶Ⅲ的siRNA前體表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄效率高，且能在大多數(shù)種類的組織細(xì)胞中表達(dá)，但很難做成可誘導(dǎo)型的siRNA表達(dá)載體，從而阻礙了對基因表達(dá)的可控調(diào)節(jié)。后來研究人員將siRNA序列替換miRNA序列并構(gòu)建到miRNA的前體上，通過RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，polⅡ)啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生類似pri-miRNA結(jié)構(gòu)的shRNAmir。這種siRNA前體可以被細(xì)胞核內(nèi)的核酸酶Drosha以及細(xì)胞質(zhì)中的Dicer進(jìn)行連續(xù)切割并進(jìn)一步產(chǎn)生成熟的siRNA，也可以有效地沉默靶基因的表達(dá)。shRNAmir的主要優(yōu)點(diǎn)是可以通過選擇不同類型的RNA聚合酶Ⅱ啟動子進(jìn)行組織特異性的表達(dá)siRNA，以及通過可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的啟動子，從而達(dá)到對靶基因表達(dá)的可控調(diào)控。

目前國際上廣泛使用的shRNAmir表達(dá)載體主要是用人miR-30的骨架為基礎(chǔ)構(gòu)建的，如OpenBiosystem，但其介導(dǎo)的基因沉默效率總體偏低，并且由于miRNA的加工過程造成所在慢病毒載體包裝成病毒顆粒的效率顯著降低。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的siRNA載體，從而更好地應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病治療。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效地可誘導(dǎo)調(diào)控或組織特異性調(diào)控靶基因表達(dá)的基于miRNA前體的siRNA表達(dá)載體。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種短發(fā)夾RNA(shRNA)序列，所述shRNA序列為核苷酸序列，并且從5′端到3′端依次具有以下區(qū)域：

(a)5′端旁側(cè)序列區(qū)，所述5′端旁側(cè)序列區(qū)長度大于或等于17nt；

(b)5′端配對siRNA區(qū)域，所述5′端配對siRNA區(qū)域長度大于或等于19nt；

(c)頂端環(huán)區(qū)域，所述頂端環(huán)區(qū)域的序列如SEQ ID NO.:1所示(UGUGCUGUC)；

(d)3′端配對siRNA區(qū)域，所述3′端配對siRNA區(qū)域長度大于或等于19nt，并且所述5′端配對siRNA區(qū)域與3′端配對siRNA區(qū)域形成雙鏈siRNA區(qū)域，所述雙鏈區(qū)域長度大于或等于19bp；

(e)3′端旁側(cè)序列區(qū)，所述3′端旁側(cè)序列區(qū)長度大于或等于17nt；

其中，所述shRNA序列產(chǎn)生siRNA，且所述siRNA的核苷酸序列對應(yīng)于所述3′端配對siRNA區(qū)域或5′端配對siRNA區(qū)域。

在另一優(yōu)選例中，所述5′端旁側(cè)序列區(qū)長度大于20nt。

在另一優(yōu)選例中，所述5′端配對siRNA區(qū)域長度為20-25nt。