[發(fā)明專利]單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610488457.0
• 申請日: 2016-06-24
• 公開（公告）號: CN107557463A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盛司潼;龔敬文
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州康昕瑞基因健康科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11;C12Q1/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒。

背景技術(shù)

聚合酶作為一種重要的工具酶，廣泛應(yīng)用于基因測序、載體制備及基因克隆等一系列重要的分子生物學(xué)技術(shù)之中。目前，市場上常見的DNA聚合酶活性單位定義如下：以濃度為0.75 mM的被激活的小牛胸腺DNA為模板，在反應(yīng)條件為72℃，1×反應(yīng)緩沖液（包含200 mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM MgSO₄、100 mM KCl、100 mM (NH₄)₂SO₄、1% Triton X-100、1 mg/mL nuclease-free BSA），0.4 MBq/mL [3H]-dTTP下反應(yīng)30 min，能催化10 nmol的dNTP聚合生成多核苷酸片段的酶量為1單位酶活，即1U。相應(yīng)的，市場上常見的聚合酶活性測定方法主要是放射性同位素標記結(jié)合凝膠電泳。但是，因為同位素存在輻射，對人體有害，在使用過程中對實驗室的要求很高，實驗過程中的所有試劑、耗材等均需專門處理，否則會污染環(huán)境。一般實驗室、公司和研究機構(gòu)均不具備進行同位素標記法實驗的條件。此外，這種方法測定的活性線性范圍較窄，操作也比較復(fù)雜費時；基于該方法的試劑盒成本高，使用后需經(jīng)特殊處理才能不污染環(huán)境。

因此，需要一種不依賴于同位素標記的聚合酶活性測定方法及試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒、旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中聚合酶活性測定對環(huán)境壓力大，成本高的問題。

為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種單鏈核酸分子，所述單鏈核酸分子包括莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)和單鏈區(qū)；所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)位于所述單鏈核酸分子的3'端，且從5'到3'方向依次包括第一配對區(qū)、單鏈環(huán)區(qū)和第二配對區(qū)；所述第一配對區(qū)和第二配對區(qū)互補配對；所述單鏈環(huán)區(qū)為單鏈核苷酸序列；所述單鏈區(qū)為位于所述單鏈核酸分子5'端的單鏈核苷酸序列。

優(yōu)選的，所述單鏈區(qū)為由多個重復(fù)單元組成的單鏈核苷酸序列，所述重復(fù)單元是長度為1-10bp的單鏈核苷酸序列。

更優(yōu)選的，所述重復(fù)單元是長度為1-3bp的單鏈核苷酸序列。

進一步優(yōu)選的，所述重復(fù)單元為d（A）、d（T）、d（C）、d（G）、A、G、C或U。

所述單鏈區(qū)長度在15-150之間。

優(yōu)選的，所述第一配對區(qū)在5-15bp之間。

優(yōu)選的，所述單鏈環(huán)區(qū)為（dA）_a、（dT）_a、（dC）_a、（dG）_a、（A）_a、（G）_a、（C）_a或（U）_a。

優(yōu)選的，所述a在3-20之間。

優(yōu)選的，所述單鏈核酸分子上含有淬滅基團。

優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)、第二配對區(qū)或單鏈區(qū)的3'端。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團位于第一配對區(qū)或第二配對區(qū)。

優(yōu)選的，所述淬滅基團為TAMRA、MGB或BHQ。

更優(yōu)選的，所述淬滅基團為MGB或BHQ。

本發(fā)明還提供了一種聚合酶活性測定方法，包括以下步驟：

A、制備聚合酶延伸反應(yīng)體系并進行聚合酶延伸反應(yīng)，所述反應(yīng)體系包括單鏈核酸分子、待測聚合酶、底物和適宜所述待測聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；

B、終止聚合酶延伸反應(yīng)，并通過熒光檢測裝置檢測所述反應(yīng)體系中反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)合雙鏈DNA染料產(chǎn)生的第一熒光強度，以所述第一熒光強度表征待測聚合酶活性；所述雙鏈DNA染料在反應(yīng)體系制備時加入，或在所述聚合酶延伸反應(yīng)過程中的任意時刻加入，或在所述聚合酶延伸反應(yīng)終止時或終止后加入；

所述單鏈核酸分子為上述任一種單鏈核酸分子；所述底物為dNTP和/或NTP。

其中，所述待測聚合酶為熱啟動聚合酶，所述聚合酶延伸反應(yīng)開始前還包括熱啟動步驟。

優(yōu)選的，所述待測聚合酶為Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Klenow Fragment（3'-5'exo-）DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶或phi29 DNA聚合酶。

優(yōu)選的，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。