[發(fā)明專利]單鏈核酸分子、聚合酶活性測定方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610488457.0
• 申請日: 2016-06-24
• 公開（公告）號: CN107557463A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 盛司潼;龔敬文
• 申請（專利權）人: 廣州康昕瑞基因健康科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11;C12Q1/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種單鏈核酸分子，其特征在于，所述單鏈核酸分子包括莖環(huán)結構區(qū)和單鏈區(qū)；所述莖環(huán)結構區(qū)位于所述單鏈核酸分子的3'端，且從5'到3'方向依次包括第一配對區(qū)、單鏈環(huán)區(qū)和第二配對區(qū)；所述第一配對區(qū)和第二配對區(qū)互補配對；所述單鏈環(huán)區(qū)為單鏈核苷酸序列；所述單鏈區(qū)為位于所述單鏈核酸分子5'端的單鏈核苷酸序列。

2.根據(jù)權利要求1所述的單鏈核酸分子，其特征在于，所述單鏈區(qū)為由多個重復單元組成的單鏈核苷酸序列，所述重復單元是長度為1-10bp的單鏈核苷酸序列。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的單鏈核酸分子，其特征在于，所述單鏈區(qū)的長度為15-150bp。

4.一種聚合酶活性測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、制備聚合酶延伸反應體系并進行聚合酶延伸反應，所述反應體系包括單鏈核酸分子、待測聚合酶、底物和適宜所述待測聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；

B、終止聚合酶延伸反應，并通過熒光檢測裝置檢測所述反應體系中反應產(chǎn)物結合雙鏈DNA染料產(chǎn)生的第一熒光強度，以所述第一熒光強度表征待測聚合酶活性；所述雙鏈DNA染料在反應體系制備時加入，或在所述聚合酶延伸反應過程中的任意時刻加入，或在所述聚合酶延伸反應終止時或終止后加入；

所述單鏈核酸分子為權利要求1-3中任一項所述的模板-引物核酸分子；所述底物為dNTP和/或NTP。

5.根據(jù)權利要求4所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述待測聚合酶為熱啟動聚合酶，所述聚合酶延伸反應開始前還包括熱啟動步驟。

6.根據(jù)權利要求4所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

7.根據(jù)權利要求4-6中任一項所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，還包括以下步驟：

C、根據(jù)第二熒光強度與參照品的量的標準曲線，將所述第一熒光強度換算成參照品的量，以所述參照品的量表征待測聚合酶活性；所述參照品為由兩條單鏈核苷酸序列完全互補配對形成的雙鏈核酸分子，或具有莖環(huán)結構且3'端和5'端完全互補配對的單鏈核酸分子；所述第二熒光強度為所述參照品結合雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光強度。

8.根據(jù)權利要求7所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，還包括以下步驟：

D、將所述參照品的量換算為底物消耗量，以所述底物消耗量來表征待測聚合酶活性。

9.一種聚合酶活性測定方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、制備一系列包括不同待測聚合酶酶量的聚合酶延伸反應體系并進行聚合酶延伸反應，所述反應體系還包括單鏈核酸分子、底物和適宜所述待測聚合酶發(fā)揮活性的緩沖液；

B、終止聚合酶延伸反應，并通過熒光檢測裝置檢測所述各反應體系中反應產(chǎn)物結合雙鏈DNA染料產(chǎn)生的第一熒光強度；擬合所述第一熒光強度與所述待測聚合酶酶量之間的關系曲線，以待測聚合酶酶量在關系曲線中對應的第一熒光強度表征所述待測聚合酶活性；所述雙鏈DNA染料在反應體系制備時加入，或在所述聚合酶延伸反應過程中的任意時刻加入，或在所述聚合酶延伸反應終止時或終止后加入；

所述單鏈核酸分子為權利要求1-3中任一項所述的模板-引物核酸分子；所述底物為dNTP和/或NTP。

10.根據(jù)權利要求9所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，所述所述雙鏈DNA染料為Eva Green、Sybr Green I、SYTO9、BEBO、BOXTO或PicoGreen。

11.根據(jù)權利要求9或10所述的聚合酶活性測定方法，其特征在于，還包括以下步驟：

C、根據(jù)熒第二光強度與參照品的量的標準曲線，將所述第一熒光強度換算成對應的參照品的量；擬合所述參照品的量與所述待測聚合酶酶量之間的關系曲線，以待測聚合酶酶量在關系曲線中對應的參照品的量表征所述待測聚合酶活性；所述參照品為由兩條單鏈核苷酸序列完全互補配對形成雙鏈核酸分子，或具有莖環(huán)結構且3'端和5'端完全互補配對的單鏈核酸分子；所述第二熒光強度為所述參照品結合雙鏈DNA染料產(chǎn)生的熒光強度。