[發明專利]一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法

有效

• 申請號: 201610486096.6
• 申請日: 2016-06-27
• 公開（公告）號: CN105929159B
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 孫培明
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02
• 代理公司: 貴陽派騰陽光知識產權代理事務所(普通合伙)52110
• 代理人: 管寶偉

技術領域

本發明涉及卵黃抗體監測技術領域，具體是涉及一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法。

背景技術

H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，是常見的家禽傳染病之一，容易與其它疫病發生混合感染，可造成養禽業(包括雞、鴨、鴿、鵪鶉等)的一定經濟損失，通過疫苗免疫是我國最主要的防控措施，免疫產生的抗體效價高低直接決定著免疫質量和防控成敗。由于免疫接種容易受到多種因素的影響，如疫苗因素、動物因素、飼養管理因素、疾病因素等，而且動物的免疫反應看不見、摸不著，所以免疫質量存在很大的不確定性，這給疫病防控帶來極大的困難。抗體監測是檢驗免疫質量最直接、最有效的方法，通過抗體監測可以確定科學的免疫程序、合理的免疫時間，選擇優質的疫苗、準確的免疫劑量，從而確保免疫效果。抗體監測還可以提示H9亞型禽流感發生的風險，如果抗體效價低于4log2，雞群的抗體不足以抵抗病毒的侵襲，發病的風險增大，定期進行H9亞型禽流感抗體監測可以評估疫苗免疫質量和預警疫病的發生，是預防控制H9亞型禽流感的重要措施。

抗體監測是利用免疫學試驗的原理，用已知抗原檢測相應特異性抗體的方法，其在免疫質量評估、疫病診斷、疫病監測、疫情預警、疫病控制等方面發揮重要作用，是動物疫病防控的主要技術手段。抗體監測主要以血清抗體效價為標準，利用血清學試驗檢測血清抗體，常用的方法有血凝試驗(HA)、血凝抑制試驗(HI)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等，其中HA和HI是禽流感抗體監測的最常用方法。血清抗體監測具有結果準確、可靠的優點，但同時具有操作繁瑣、影響雞健康和生產性能的缺點。因為需要采血和分離血清，操作過程繁瑣，浪費人力和時間，同時采血引起的應激會給養雞生產造成不良影響，從而導致血清抗體監測在實踐應用中受到一定的限制。然而，與血清制備相比，卵黃制備更加簡便和安全，只需要收集雞蛋，不需要采血，所以用卵黃代替血清進行抗體監測具有一定的優勢和推廣價值，我國早在20世紀80年代就有用卵黃抗體代替血清抗體進行新城疫抗體監測的報道。

卵黃抗體(IgY)是禽類在抗原刺激下產生的沉積于卵黃中的針對特定抗原的抗體，是禽類在長期進化過程中形成的用于提高雛禽抵抗力的物質。當家禽受到外來抗原刺激后，法氏囊內的B細胞分化成為漿細胞，分泌特異性抗體進入血液循環；當血液流經卵巢時，特異性抗體選擇性地(主要是IgG)轉移并沉積到卵黃，形成卵黃抗體；IgG在卵細胞中具有蓄積作用，所以卵黃抗體的濃度高于血清中的抗體濃度。自1893年KIemperer首次報道雞蛋中存在抗體以來，人們對卵黃抗體的認識不斷加深，相關研究也愈來愈受到關注，其中用卵黃抗體代替血清抗體進行抗體監測是其中內容之一。當前用于檢測禽流感卵黃抗體的方法有多種，如氯仿提取法、生理鹽水提取法、磷酸鹽緩沖液提取法等，其中氯仿提取法使用最多。雖然氯仿提取法是最接近血清抗體的方法，但是結果仍然存在準確性和穩定性的問題，這是卵黃抗體代替血清抗體進行禽流感抗體監測最大的難題。卵黃抗體監測雖然具有操作簡便、安全的優點，但同時具有結果不準確、不可靠的缺點。

卵黃抗體是指禽類經免疫后卵黃內含有的特異性抗體；血清抗體是禽類經免疫后血清內含有的特異性抗體；血凝抑制試驗是指某些具有凝集紅細胞能力的病毒(或抗原)能被相應抗體抑制，原理是相應抗體與病毒(或抗原)結合后，阻止病毒(或抗原)表面血凝素與紅細胞結合，常用于正粘病毒、副粘病毒的診斷和抗體監測；抗體監測是通過免疫學實驗的方法，即用已知抗原檢測被檢樣品中有無相應的特異性抗體，其主要作用是檢驗免疫性與免疫效果，對于抗體監測中發現免疫效果不好則可提示需要加強免疫或調整免疫程序，是動物疫病預防控制工作中重要的技術手段，具備重要的參考價值，并非疾病的診斷與治療方法。

在禽類疫病的抗體監測中，血清抗體檢測結果可靠眾所周知，但是血清抗體監測需要采血，在生產中有一定的技術難度，還會產生應激，影響家禽的健康和生產性能；卵黃抗體檢測不需要采血，只需要提供禽蛋，不會產生應激，不會影響家禽的健康和生產性能。禽流感病毒的抗體監測一直以血清抗體效價為標準，而卵黃抗體效價與血清抗體效價存在一定的差距，致使卵黃抗體檢測在生產中得不到推廣應用。卵黃抗體的效價的確定是卵黃代替血清的關鍵點，相較于血清抗體的效價檢測技術非常成熟，卵黃抗體存在于卵黃中，屬于非均相液態物混合，現有的技術很難保證卵黃抗體檢測結果的可靠性，往往不是偏低就是偏高，單一方法很難保證所得的卵黃抗體效價的可靠性。

申請人通過實驗發現，針對卵黃進行H9亞型禽流感抗體效價監測，用氯仿處理一般效價偏低，而用水處理一般效價偏高，申請人認為其基于以下的機理：