[發明專利]一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法

有效

• 申請號: 201610486096.6
• 申請日: 2016-06-27
• 公開（公告）號: CN105929159B
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 孫培明
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: C07K16/02
• 分類號: C07K16/02
• 代理公司: 貴陽派騰陽光知識產權代理事務所(普通合伙)52110
• 代理人: 管寶偉

1.一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法，其特征在于，步驟如下：

(1)卵黃原料采集

雞蛋采集是在養禽場中隨機采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來自整個雞群的分散度；將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開直徑1cm的洞，撕開殼膜將蛋清完全倒出，再打開蛋殼將蛋黃完整倒入培養皿，進而挑開卵黃囊，用注射器直接避開表面蛋清抽取卵黃，將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用；

(2)卵黃抗體提取

A、水溶性處理液提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml水溶性處理液，充分振蕩混勻，室溫放置1h，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用；

B、氯仿提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充分振蕩混勻，室溫放置1h，期間攪拌混勻3次，再通過3000r/min離心10min，出現分層，上層為卵黃抗體提取液B，分離備用；

(3)兩種提取方式卵黃液的混合

將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監測用卵黃抗體樣品；

(4)血凝試驗

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍數稀釋的H9亞型禽流感抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次類推做等量倍比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25μL；設立第12列孔為紅細胞對照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％雞紅細胞懸液25μl；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；觀察數次，直至對照的紅細胞全部沉淀為一個圓點，將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無淚珠樣流掛，根據血凝圖像判定結果；

血凝效價高于2¹¹時可繼續增加稀釋的孔數，以出現完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價，此時血凝效價為2ⁿ，n>11，再根據初始稀釋度計算抗原的血凝單位；并根據測定的抗原的血凝效價，計算4個血凝單位抗原的稀釋倍數，制備4個血凝單位抗原；

(5)血凝抑制試驗與效價確認

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS；

將步驟3的混合液，取體積25μl于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11列孔，最后棄去25μl；第1列孔至第12列孔分別加25μl含4個血凝單位的H9亞型禽流感抗原；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；每孔加0.75％雞紅細胞懸液25μl；混合后置室溫下作用40min或在4℃下作用60min，此時對照的紅細胞已沉淀為一個圓點；血凝抑制效價高于2¹¹時可繼續增加稀釋的孔數，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該混合液的血凝抑制效價，測定抗體效價加上修訂系數即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價。

2.如權利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的水溶性處理液為生理鹽水、枸櫞酸鈉溶液或磷酸鹽緩沖液中的任意一種。

3.如權利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法，其特征在于：步驟(3)中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A：50％，卵黃抗體提取液B：50％。

4.如權利要求1所述的一種新的H9亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監測的方法，其特征在于：所述步驟(5)得到的血凝抑制效價，加上修訂系數，修訂系數受疫苗、免疫時期、免疫程序影響，修訂后的效價作為卵黃抗體替代血清抗體的H9亞型禽流感血凝抑制效價。