[發(fā)明專利]一種藥食同源藥材酸棗仁及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610460257.4
• 申請(qǐng)日: 2016-06-23
• 公開（公告）號(hào): CN107475359B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雅琴;馮紅;馬孝熙;凃媛;張?zhí)m蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 數(shù)字本草檢測(cè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

本發(fā)明涉及一種酸棗仁真?zhèn)舞b定方法，所述方法包括如下步驟：1)待測(cè)樣品DNA提取，提取的DNA序列經(jīng)過PCR擴(kuò)增，再經(jīng)CodonCode Aligner拼接，獲得psbA?trnH序列；2)和酸棗仁psbA?trnH序列進(jìn)行K2P遺傳距離和系統(tǒng)聚類樹比較；3)如待測(cè)樣品的種內(nèi)最大K2P遺傳距離小于其與偽品最小種間K2P遺傳距離，或經(jīng)系統(tǒng)聚類樹比較為同一支，則待測(cè)樣品為真品。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及酸棗仁及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法

背景技術(shù)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphusjujube Mill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟種子。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，在歷版的《中華人民共和國(guó)藥典》中均有收錄，主產(chǎn)于我國(guó)北方地區(qū)，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝，寧心安神，斂汗，生津的功效，中醫(yī)臨床上常用的傳統(tǒng)中藥之一。由于其有助眠、降血壓、降血脂、保護(hù)心臟、保護(hù)眼睛等保健功效，久服能“安五臟，輕身延年”，是衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源兩用品之一，廣泛用于藥品及保健食品中。然而隨著近年來酸棗仁的野生資源減少、價(jià)格上漲、市場(chǎng)需求量增加，市場(chǎng)上出現(xiàn)以滇刺棗Ziziphus mauritiana Lam.(理?xiàng)椚?，北枳椇Hoveni adulcis Thunb.(拐棗仁)，兵豆Lens culinaris，紫荊Cercis chinensis的種子摻雜摻偽的現(xiàn)象。滇刺?hào)页７Q為“理?xiàng)椚省被颉斑M(jìn)口酸棗仁”，由于其價(jià)格低、與酸棗仁藥材的外觀形態(tài)相似，在藥材市場(chǎng)中存在將其充當(dāng)或摻入酸棗仁的假冒、摻偽現(xiàn)象。

目前，張軍武、李俊卿等采用外觀性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、紫外光譜鑒別對(duì)酸棗仁及其混偽品進(jìn)行鑒別，劉萍等采用RAPD鑒別酸棗仁及其混淆品(劉萍等.酸棗仁與其混淆品及偽品的RAPD分析[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2006,22(1):67.)，然而這些鑒定方法均存在一定的缺陷：外觀性狀及顯微性狀對(duì)技術(shù)人員的專業(yè)技術(shù)能力要求較高，更多地依賴于技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)；薄層鑒別與紫外光譜本質(zhì)上是依據(jù)某一化學(xué)成分的有無或多少進(jìn)行區(qū)分，而藥材由于種植、采收或加工原因?qū)е缕浠瘜W(xué)成分含量發(fā)生變化而易導(dǎo)致薄層鑒定、紫外光譜的結(jié)果不穩(wěn)定；RAPD存在片段的基因組來源不明(細(xì)胞核或細(xì)胞器)以及凝膠電泳遷移率相同的譜帶的核苷酸同源性等情形易造成干擾，此外，RAPD反應(yīng)條件繁雜而嚴(yán)格，擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性難以控制等問題存在。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種DNA條形碼鑒定方法來對(duì)酸棗仁及其混偽品進(jìn)行鑒別。

DNA條形碼技術(shù)是近年來在物種鑒定領(lǐng)域發(fā)展起來的一種新方法，由于其具有重復(fù)性好、通用性強(qiáng)、不依賴于藥材形態(tài)、不受環(huán)境因素影響的特點(diǎn)，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足，正在逐漸發(fā)展成為一項(xiàng)成熟、穩(wěn)定的鑒別手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥材的物種鑒定。作為國(guó)際常用的DNA條形碼分子標(biāo)記之一，葉綠體基因非編碼區(qū)中的psbA-trnH序列的鑒定效率已在肉蓯蓉、巴戟天、遠(yuǎn)志、肉桂等中藥材中得到了驗(yàn)證。本研究基于psbA-trnH序列對(duì)44份酸棗仁及其混偽品樣本進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，為保障藥食同源的酸棗仁的用藥安全與臨床療效提供新的鑒定方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明基于葉綠體基因非編碼區(qū)中的psbA-trnH序列對(duì)44份酸棗仁及其混偽品樣本進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定研究，為保障藥食同源的酸棗仁的用藥安全與臨床療效提供新的鑒定方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種酸棗仁真?zhèn)舞b定方法，包括如下步驟：

1)待測(cè)樣品DNA提取，提取的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增，再經(jīng)CodonCode Aligner拼接，獲得psbA-trnH序列；

2)和酸棗仁psbA-trnH序列進(jìn)行K2P遺傳距離和系統(tǒng)聚類樹比較；

3)如待測(cè)樣品的種內(nèi)最大K2P遺傳距離小于其與偽品最小種間K2P遺傳距離，或經(jīng)系統(tǒng)聚類樹比較為同一支，則待測(cè)樣品為真品。