[發明專利]一種藥食同源藥材酸棗仁及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法

有效

• 申請號: 201610460257.4
• 申請日: 2016-06-23
• 公開（公告）號: CN107475359B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 張雅琴;馮紅;馬孝熙;凃媛;張蘭蘭
• 申請（專利權）人: 數字本草檢測科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

1.一種酸棗仁真偽鑒定方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟(1)提取包括酸棗仁真品和酸棗仁偽品的DNA，提取的DNA序列經過PCR擴增，再經CodonCode Aligner拼接，獲得psbA-trnH序列，DNA的提取方法為：酸棗仁真品和酸棗仁偽品，種子切碎，研磨成粉狀，水浴，采用苯酚：氯仿：異戊醇的混合溶劑進行總DNA的提取；

步驟(2)根據psbA-trnH序列計算酸棗仁真品和酸棗仁偽品種內和種間遺傳距離，并構建系統聚類樹；

步驟(3)以酸棗仁真品和酸棗仁偽品的種間最小K2P遺傳距離大于酸棗仁的種內最大K2P遺傳距離為指標，以及系統聚類樹的支系為指標，得到酸棗仁真偽鑒定方法。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(1)的方法如下：

將研磨好的粉末轉移到含有0-0.1％β-巰基乙醇的緩沖液1的離心管中，迅速顛倒混勻后，將離心管放在56～65℃水浴中2-6h；

加入苯酚：氯仿：異戊醇體積比0-25：1-24：0-1，充分混勻，離心得上清液；將上清轉移到新離心管中，向上清中加入異丙醇析出DNA，形成絮狀沉淀，離心；棄上清，加入70-75％乙醇洗滌沉淀物，離心；棄去上清液乙醇，得DNA沉淀物干燥滅菌；雙蒸水溶解DNA沉淀物，加入核糖核酸酶A并在35-40℃處理10-20min，除去RNA，即得總DNA；其中步驟(1)所述的緩沖液1包括：濃度2％的CTAB 1g、100mmol/L的Tris·Cl 5mL、20mmol/L的EDTA 2mL、1.4mol/L的NaCl 4.09g、2％的PVP 1g加雙蒸餾水到50ml。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(1)所述的PCR擴增反應體系如下：10×PCR緩沖液2.5μL、25mM MgCl₂ 2.00μL、2.5μmol·L^-1引物各1.0μL、DNA模板量為3μL、2.5mM dNTP 2.00μL、Taq 0.20μL，其余體積用滅菌的雙蒸餾水補至25μL。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(1)中的PCR擴增引物如下：

正向引物:5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'，

反向引物：5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(1)中PCR擴增條件如下：94℃變性4-5min，經過35-40個循環，72℃延伸10min；瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR情況，所述循環是指94℃變性30-45s，55-60℃退火45-90s 72℃延伸45-60s。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，其中步驟(1)所述的酸棗仁偽品為枳椇子、理棗仁的藥材或兵豆、紫荊子的種子。