[發(fā)明專利]獲得病毒的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610458702.3
• 申請日: 2016-06-22
• 公開（公告）號: CN107523555A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 王學海;馬梵辛;許勇;任科云;葉煒;陳艷;袁宏麗;何昆;田呂明;黃璐;劉哲;肖強
• 申請（專利權）人: 武漢光谷人福生物醫(yī)藥有限公司;武漢珂美立德生物醫(yī)藥有限公司;湖北生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術研究院有限公司;人福醫(yī)藥集團股份公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙)11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體地，本發(fā)明涉及獲得病毒的方法。

背景技術

基因治療是將人正常基因或者有治療功能的基因導入人體靶細胞發(fā)揮治療作用，曾在2009年被評為十大成功之一，直至今天，世界各國已批準數(shù)千個基因治療臨床試驗的項目。腺病毒載體是基因治療的關鍵載體之一，表現(xiàn)出高效、靶向、不整合到細胞基因組、安全系數(shù)高、可長期表達目的基因片段、可制備高效價的病毒顆粒等優(yōu)點。故大批量生產(chǎn)腺病毒載體成為基因治療深入研究和市場推廣關鍵位點之一。

發(fā)明內(nèi)容

專利CN200480038524.4公開“生產(chǎn)在無血清的培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)中穩(wěn)定的A549細胞系的方法”，該專利中公開采用無血清馴化培養(yǎng)的A549進行生產(chǎn)腺病毒的方法。發(fā)明人經(jīng)過實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用無血清馴化培養(yǎng)的HEK293細胞生產(chǎn)病毒，如腺病毒，且生產(chǎn)過程中不添加氯化鈣，批量產(chǎn)出的腺病毒的滴度可達3×10¹²pfu/batch，腺病毒的比活大于1.5％，不僅腺病毒的產(chǎn)量更大、比活更高，而且工藝簡單無需灌注，培養(yǎng)過程中無需補加氯化鈣，減少工藝程序，降低污染風險，工藝簡單容易操作，可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本大幅降低。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出一種獲得病毒的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：利用病毒種子感染宿主細胞，所述宿主細胞為HEK293細胞，且所述宿主細胞為懸浮培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中的宿主細胞；以及將感染后的宿主細胞繼續(xù)進行懸浮培養(yǎng)，以便獲得病毒，其中，在進行所述感染時，所述病毒種子的病毒感染復數(shù)為10～50，所述宿主細胞在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.0～3.0×10⁶cells/ml。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法中所用宿主細胞HEK293是經(jīng)過無血清培養(yǎng)馴化過的HEK293細胞，該細胞相比于A549細胞，生存能力更強、產(chǎn)毒效率更高。利用根據(jù)本發(fā)明實施例的獲得病毒的方法，所得病毒滴度高、比活大，符合臨床藥用要求。且根據(jù)發(fā)明的實施例，本發(fā)明的獲得病毒的方法，工藝簡單無需灌注，培養(yǎng)過程中無需補加氯化鈣，減少工藝程序，降低污染風險，工藝簡單容易操作，可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)成本大幅降低。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述獲得病毒的方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述宿主細胞在所述無血清培養(yǎng)基中的接種密度為3.0～5.0×10⁵cells/ml。發(fā)明人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，宿主細胞以3.0～5.0×10⁵cells/ml的接種密度進行接種，可以保證接種后，宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中健康的生長狀態(tài)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，接種密度低于3.0×10⁵cells/ml，細胞密度過低，細胞生長緩慢，接種密度高于5.0×10⁵cells/ml，細胞密度過高，細胞生長受到抑制，細胞狀態(tài)受到顯著影響。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將感染后的宿主細胞繼續(xù)進行懸浮培養(yǎng)24～48h，以便獲得病毒。發(fā)明人經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，感染后的宿主細胞懸浮培養(yǎng)24～48h，此時收集病毒，可最大可能地保證病毒的活力和數(shù)量的最大化。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將感染后的宿主細胞繼續(xù)進行懸浮培養(yǎng)24～48h的過程中，葡萄糖在所述無血清培養(yǎng)基中的濃度為2～5g/L。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，病毒在感染、包裝和擴增過程中不斷地消耗葡萄糖，控制培養(yǎng)基中葡萄糖在2～5g/L，可有效保證病毒感染、包裝和擴增的高效和穩(wěn)定。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述病毒為腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒。利用本發(fā)明實施例所提出的獲得病毒的方法，可批量獲得腺病毒、慢病毒或逆轉錄病毒，病毒產(chǎn)率高、比活大。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述無血清培養(yǎng)基為Gibco CD293AGT^TM/AEM,Hyclone CDM4/SFM4/PF-293*/SFM Transfx。發(fā)明人經(jīng)過篩選實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的宿主細胞HEK293細胞在Gibco CD293AGT^TM/AEM,Hyclone CDM4/SFM4/PF-293*/SFM Transfx培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)相比于在其它培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)，更加健康，病毒產(chǎn)率更高。