[發明專利]一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數量的方法

在審

• 申請號: 201610455543.1
• 申請日: 2016-06-21
• 公開（公告）號: CN107523607A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 林培茵;洪秋雅;陳威仁
• 申請（專利權）人: 生展生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司11243
• 代理人: 許靜,黃燦

技術領域

本發明是關于一種運用Real-time PCR技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數量的方法，并運用此技術分析衍生性商品含有的菌體數量。

背景技術

聚合酶連鎖反應(英文：Polymerase chain reaction，縮寫：PCR)主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環，連續擴增目標DNA片段，使極微量的DNA放大，實時定量PCR(Real-time PCR)是在PCR過程中利用熒光探針或染料，再經由光學系統達到實時偵測(Real-time)的效果。每一次PCR擴增循環后，將其生成反應產物(熒光物質)的數量記錄下來，待反應全部完成之后，以擴增循環次數(cycle number)和生成產物量繪制作圖，可得到一反應曲線圖形，完整的呈現PCR反應中每一個擴增循環(cycle)產物的生成情形，所以稱為實時定量PCR。通過分析PCR cycle與生成產物量這兩個因素之間的相對關系，來進行實驗結果的判讀。

Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸被提高，優點包含(1).實驗時間可以大幅縮短，(2).可以在計算機上實時監測實驗結果，(3).鑒定的專一性、敏感度及準確度較傳統PCR方式高，(4).檢測過程不用進行洋菜膠體電泳分析，除了可以節省時間及洋菜膠的材料費外，也可避免多做洋菜膠體電泳分析實驗所造成的污染及操作誤差。相較之下，傳統PCR僅能用于定性分析，至多能達到「半定量(semi-quantitative)」的程度。

近幾年來，有許多文獻或專利技術，運用PCR分析或定量細菌包含益生菌的數量，說明如下。

中華人民共和國發明專利申請公布號CN 101717828 A，專利名稱「一種發酵乳制品中乳酸菌種類快速檢驗的方法」，此方法先提取發酵乳制品中乳酸菌的DNA，并將特定區域DNA進行擴增反應，此PCR產物以凝膠電泳進行分析。電泳結果與參考菌株制成的比對標準條帶進行比對，確定樣品中含有的菌種種類。此方法除了需要人工操作進行標準條帶比對，也只能將乳酸菌菌種定性，但不能定量。

中華人民共和國發明專利申請公布號CN 103525914 A，專利名稱「一種計數植物乳桿菌活菌數的方法及其引物和試劑盒」，此方法需先將樣品以平板培養基培養單菌落(單個細菌形成的菌落)，并提取活菌菌落的DNA進行PCR反應。產物利用凝膠電泳鑒定。定量計數是利用平板計數法與PCR反應比值換算可能菌數。此方法除了需要先以平板培養出單菌落，且只能將乳酸菌菌種定性，但不能定量。

中華人民共和國發明專利授權公告號CN 102994644 B，專利名稱「一種植物乳桿菌定量檢測方法及其檢驗試劑盒和應用」，此方法需提取待測樣品的總RNA，以紫外分光亮度計測定吸光值，計算拷貝數進行稀釋，并將RNA反轉錄成cDNA，再進行實時定量PCR，利用具特異性植物乳桿菌引物對，以所得cDNA為模版進行熒光PCR擴增。此方法只檢測樣品中存活的植物乳桿菌數量。

文獻「分子信標實時PCR法快速檢測雙歧桿菌的研究」(微生物學通報2007)，利用Real-time PCR分析并定量雙歧桿菌活菌數，揭露的益生菌的菌種、引物設計，皆與本發明不同，且只能分析活菌菌數。

臺灣衛福部公告的食品微生物檢驗方法-乳酸菌-乳酸雙叉乳酸桿菌的檢驗，本檢驗方法適用范圍食品中乳酸雙叉乳桿菌(Bifidobacterium lactis)的菌種鑒別，但此方法無法定量乳酸菌菌數。

世界專利合作條約(PCT)WO2010151124，專利名稱Selection of a nutritional composition capable of promoting health(促進健康營養的組合物的篩檢)，揭露利用PCR進行益生菌菌種鑒定，此發明僅利用PCR進行乳酸菌定性，而無法定量乳酸菌菌數。