[發(fā)明專利]一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610455543.1
• 申請日: 2016-06-21
• 公開（公告）號: CN107523607A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 林培茵;洪秋雅;陳威仁
• 申請（專利權）人: 生展生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京銀龍知識產(chǎn)權代理有限公司11243
• 代理人: 許靜,黃燦

1.一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，該方法包含下列步驟：

步驟1：取一檢品溶解于無菌水中，以高速離心，將菌體離下，加入無菌水稀釋，作為待測菌樣品；

步驟2:待測菌樣品以實時定量聚合酶連鎖反應搭配目標菌專一性引物組；其中該目標菌專一性引物組是以目標菌的保守基因，包含16S rDNA、23S rDNA，16S-23S rDNA的內(nèi)轉錄區(qū)或持家基因序列片段作為擴增目標，其中該目標菌為益生菌或病原菌；

以擴增片段的熔解曲線有無專一性波峰，確定該待測菌樣品是否含有非目標菌種；

步驟3:將獲得的檢品Ct值帶入標準品制得的標準曲線的回歸方程式，可以得知待測菌樣品的菌體數(shù)量。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述益生菌包括雙歧桿菌屬、腸球菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述雙歧桿菌屬包含嬰兒雙歧桿菌、乳酸雙歧桿菌、長雙歧桿菌；其中該腸球菌屬包含糞腸球菌、屎腸球菌；其中該乳酸桿菌屬包含嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、副干酪乳桿菌、唾液乳桿菌；其中該鏈球菌屬包含嗜熱鏈球菌。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述病原菌包含產(chǎn)氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述專一性引物組是以目標菌的保守基因，包含16S rDNA、23S rDNA、16S-23S rDNA的內(nèi)轉錄區(qū)、持家基因等序列片段作為擴增目標；其中持家基因包含dnaK、fusA、groEL、gyrB、recA、tuf。

6.根據(jù)權利要求1或5所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述專一性引物長度為16～25bp，引物組擴增的片段長度為50～150bp。

7.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述實時定量聚合酶連鎖反應的循環(huán)條件為：(1)94～95℃，10分鐘；(2)94～95℃，10～15秒；(3)55～60℃，60～70秒；(4)94～95℃，10～15秒；(5)55～60℃，60～70秒(6)94～95℃，10～15秒；其中設定條件(2)與(3)重復30～45個循環(huán)。

8.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述實時定量聚合酶連鎖反應的循環(huán)條件為：(1)95℃，10分鐘；(2)95℃，15秒；(3)57℃，60秒(4)95℃，15秒；(5)55℃，60秒(6)95℃，15秒；條件(2)～(3)重復40個循環(huán)。

9.根據(jù)權利要求1或5所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述專一性引物組序列為SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2，可用以擴增副干酪乳桿菌的序列片段。

10.根據(jù)權利要求1或5所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述專一性引物組序列為SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4，可用以擴增發(fā)酵乳桿菌的序列片段。

11.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述檢品包括含有益生菌的食品、醫(yī)藥品、潔牙產(chǎn)品、化工產(chǎn)品、飼料添加劑，該潔牙產(chǎn)品包含牙膏、漱口水、牙粉。

12.根據(jù)權利要求1所述的一種以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法，其特征在于，所述以分子生物學技術分析并定量益生菌和病原菌菌體數(shù)量的方法的運用于包括食品或醫(yī)藥品中病原菌分析、化工產(chǎn)品是否遭受病菌污染。