[發(fā)明專利]熒光探針的制備方法及基于熒光探針的土霉素檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610451659.8
• 申請(qǐng)日: 2016-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN105884806B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許小平;胥智群;歐敏銳;祝令輝;谷俊杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07F5/02
• 分類號(hào): C07F5/02;C09K11/06;C09B57/00;G01N21/64
• 代理公司: 福州君誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光探針的制備方法及基于熒光探針的土霉素檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

抗生素是一類特殊藥品,可用于人類疾病的感染治療，或作為獸藥以防止牲畜的細(xì)菌感染和增加它們的增長率。土霉素(Oxytetlacycline,OTC)，別名地霉素，地靈霉素，氧四環(huán)素，四環(huán)素等，屬于四環(huán)素類抗生素，廣泛用于動(dòng)物感染性疾病的治療。在動(dòng)物飼料中，其經(jīng)常作為獸藥抗生素和生產(chǎn)促進(jìn)劑而廣泛使用，已經(jīng)導(dǎo)致它在食品，如肉，奶和蛋制品積累，并已經(jīng)對(duì)人體健康造成了嚴(yán)重威脅。我國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國，僅2003年我國僅土霉素產(chǎn)量就達(dá)到了一萬噸，占世界土霉素生產(chǎn)總量的65％。隨著環(huán)境中微量污染物問題被不斷提出，對(duì)這些抗生素的檢測(cè)就越來越重要，而抗生素的檢測(cè)方法成為相關(guān)研究的重要因素。

用于探測(cè)土霉素的傳統(tǒng)方法主要有以下幾種：酶聯(lián)免疫吸附法，色譜法和毛細(xì)管電泳法，包括色譜質(zhì)譜連用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。然而這些方法，要么是步驟繁瑣，且所用的試劑多是一些環(huán)境不友好型試劑；要么需要使用到復(fù)雜而昂貴的儀器和較長的檢測(cè)時(shí)間，實(shí)用性差。因此，發(fā)展一種高效快速的土霉素檢測(cè)方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于客服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種合成簡單、成本較低、反應(yīng)條件溫和的熒光探針的制備方法，并利用該探針對(duì)食品、環(huán)境、生物樣品等中的土霉素進(jìn)行熒光檢測(cè)。該檢測(cè)方法具有靈敏度高、選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)稱取吡咯和戊二酸酐溶于適量二氯甲烷中，得到混合物，然后迅速將混合物加入到三口燒瓶中，在N₂保護(hù)下，用滴液漏斗向三口燒瓶中逐滴加入三氟化硼乙醚絡(luò)合物，于常溫下充分?jǐn)嚢瑁磻?yīng)8-9小時(shí)；

所述吡咯、戊二酸酐、三氟化硼乙醚絡(luò)合物的摩爾比為2：1：6-8；

(2)在冰浴的環(huán)境下，用滴液漏斗向三口燒瓶中緩緩加入三乙胺，攪拌3.5-4小時(shí)后停止反應(yīng)；

所加入的三乙胺與三氟化硼乙醚絡(luò)合物的摩爾比為1：1-1.25；

(3)將上述步驟得到的反應(yīng)液用石油醚和二氯甲烷的混合溶液萃取3次，收集下層極性較大的二氯甲烷層(黃綠色溶液)，所述石油醚和二氯甲烷的體積比為2-2.5:1；

(4)將萃取得到黃綠色溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，收集固體，所述固體用二氯甲烷溶解后，用硅膠柱層析分離，收集中間一段亮綠色溶液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，收集固體并干燥后，得到紅棕色固體，即熒光探針。

所述硅膠柱層析分離采用的淋洗劑為甲醇和二氯甲烷的混合液，所述甲醇和二氯甲烷的體積比為1:3-4。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于本發(fā)明所述熒光探針的土霉素檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：制備系列不同濃度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，取若干支試管，分為空白熒光對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，所有試管中加入磷酸鹽緩沖溶液和熒光探針，然后向?qū)嶒?yàn)組的試管中加入不同濃度的土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白熒光對(duì)照組不加土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定所有試管中溶液的熒光強(qiáng)度；

空白熒光對(duì)照組的熒光強(qiáng)度為F₀，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度為F，計(jì)算減弱的熒光強(qiáng)度△FI＝F₀-F，以不同的土霉素的濃度C₀與對(duì)應(yīng)減弱的熒光強(qiáng)度△FI作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

(2)測(cè)定樣品中土霉素濃度：按照步驟(1)的方法，向試管中加入磷酸鹽緩沖溶液和熒光探針，然后向試管中加入待檢測(cè)樣品，測(cè)定試管中加入樣品前后溶液的熒光強(qiáng)度并計(jì)算變化值，將檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)比，推算出待檢測(cè)樣品中土霉素含量。

所述熒光探針與磷酸鹽緩沖溶組成的混合物中，熒光探針的摩爾濃度為1.0×10^-5mol/L。

所述熒光探針與磷酸鹽緩沖溶組成的混合物中，磷酸鹽緩沖溶液的摩爾濃度為10-15mmol/L，pH＝7.0。

所述熒光強(qiáng)度測(cè)定參數(shù)為：激發(fā)光狹縫為1.5nm，發(fā)射光狹縫為1.5nm，激發(fā)光波長為358nm。

進(jìn)一步，為確保熒光檢測(cè)的準(zhǔn)確性，加入土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液或待檢測(cè)樣品8-10min后再測(cè)定熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，使用熒光法檢測(cè)土霉素，以氟硼熒光染料(BODIPY)為熒光團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如下：

所采用的熒光探針的合成路線如下：