[發(fā)明專利]基因敲除方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610439385.0
• 申請日: 2016-06-17
• 公開（公告）號: CN107513538A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設計）人: 魏文勝;周悅欣;張鴻敏
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)11535
• 代理人: 劉元霞,牛艷玲

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)，具體涉及基因敲除方法。

背景技術(shù)

基因編輯技術(shù)徹底改變了對基因功能的實驗研究。三種主要的技術(shù)，ZFN(鋅指核酸酶)[1]，TALENs(轉(zhuǎn)錄激活物樣效應子核酸酶)[2-4]和CRISPR/Cas9系統(tǒng)[5-7]，使用不同的機制產(chǎn)生序列特異性雙鏈斷裂(double-strand breaks,DSBs)并隨后引發(fā)天然修復系統(tǒng)完成序列特異性修飾[8,9]。這些技術(shù)在功能基因研究[10]、染色體位點的動態(tài)和實時成像[11,12]、疾病突變的校正[13]、基因治療[14]等方面具有廣泛的應用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其高效性和易于操作，變得特別受歡迎。CRISPR/Cas9系統(tǒng)原本被細菌免疫系統(tǒng)用來抵御外源病毒或質(zhì)粒，在II類CRISPR系統(tǒng)中，Cas9核酸內(nèi)切酶在sgRNA的引導下切割雙鏈DNA，造成基因組雙鏈斷裂，利用細胞基因組修復的不穩(wěn)定性產(chǎn)生修復錯誤(堿基的缺失或插入)，從而產(chǎn)生基因編輯的效果。

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基于設計的和序列特異性的基因組研究中具有前所有未有的優(yōu)勢，但CRISPR/Cas9系統(tǒng)引發(fā)的基因編輯在細胞群體中仍然屬于稀有事件，要得到真正的基因被編輯的單克隆，需要進行繁瑣的勞動，因此該系統(tǒng)在技術(shù)上仍然具有挑戰(zhàn)性，即使是對于在哺乳動物細胞中產(chǎn)生基因敲除這樣的簡單任務來說[15]。已進行了各種努力來提高產(chǎn)生基因敲除的方案的效率，例如整合CRISPR/Cas9系統(tǒng)以永久表達Cas9和sgRNA[16]、預先產(chǎn)生穩(wěn)定表達Cas9的細胞系[17]、增強非同源末端連接(NHEJ)途徑[18]、通過同時破壞能實現(xiàn)特異性藥物選擇的單獨基因來富集基因-靶向事件[19]、以及使用代理報告子(surrogate reporter)富集基因敲除[20,21]。但是，各種缺點限制了這些技術(shù)的廣泛應用。特別是，在哺乳動物細胞中產(chǎn)生多基因敲除仍然是難以完成的任務。當使用傳統(tǒng)方法時，即使是敲除單個基因有時也是長時間的，繁重的和高風險的任務[22]，因為它們?nèi)狈邪谢蛐揎椀南∩倏寺〉挠行Ц患?/p>

如果靶基因的破壞可以導致能夠用于富集的表型變化，可以容易地獲得基因敲除克隆，例如Hela CSPG4^-/-細胞賦予了對艱難梭菌(Clostridium difficile)毒素B的抗性[23]。但是，該策略無法通用。傳統(tǒng)方法是要共轉(zhuǎn)染表達抗生素抗性或熒光蛋白的質(zhì)粒[23,24]，但是這種方法不會富集含有靶向修飾的少量細胞。

已報道，外源dsDNA片段可能通過不同的修復機制被整合到具有DSBs的染色體位點上。通過同源重組(HR)修復需要構(gòu)建長側(cè)翼序列，整合效率較低，而通過非同源末端連接(Non-Homologous end joing,NHEJ)DNA修復的整合效率[27,28]通常高于同源重組修復[29]。已有研究使用CRISPR/Cas引發(fā)的NHEJ介導外源線性供體DNA的插入，以達到基因敲入的目的[30-34]。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供供體構(gòu)建體，以及基因敲除方法及其系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明的基因敲除方法利用所述供體構(gòu)建體中包含的標記物基因富集被基因敲除的細胞，提高通過序列特異性核酸酶產(chǎn)生基因敲除的效率。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供供體構(gòu)建體，所述供體構(gòu)建體是線性供體DNA或可在細胞中被切割產(chǎn)生線性供體DNA，所述線性供體DNA由中間向兩端依次包含：表達盒；位于表達盒5'端的由反向終止密碼子組成的短的序列延伸和位于表達盒3'端的由正向終止密碼子組成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的靶序列，所述靶序列含有可被所述序列特異性核酸酶切割的靶位點；位于兩端的保護序列；其中所述表達盒包含由啟動子驅(qū)動的標記物基因。

在本發(fā)明中，所述線性供體DNA是雙鏈線性供體DNA。

在優(yōu)選的實施方案中，所述供體構(gòu)建體是線性供體DNA。

在一些實施方案中，所述序列特異性核酸酶是鋅指核酸酶(ZFN)。

在另一些實施方案中，所述序列特異性核酸酶是轉(zhuǎn)錄激活物樣效應子核酸酶(TALEN)。

在另一些實施方案中，所述序列特異性核酸酶是Cas9核酸酶。

在另一些實施方案中，所述序列特異性核酸酶是NgAgo核酸酶。

在一些實施方案中，所述線性供體DNA僅在5'端或3'端具有靶序列。

在一些實施方案中，所述線性供體DNA在兩端分別具有靶序列。

在一些實施方案中，所述線性供體DNA中兩端的靶序列相同。