[發(fā)明專利]基因敲除方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610439385.0
• 申請日: 2016-06-17
• 公開（公告）號: CN107513538A
• 公開（公告）日: 2017-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏文勝;周悅欣;張鴻敏
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11535
• 代理人: 劉元霞,牛艷玲

1.提供供體構(gòu)建體，所述供體構(gòu)建體是線性供體DNA或可在細(xì)胞中被切割產(chǎn)生線性供體DNA，所述線性供體DNA由中間向兩端依次包含：表達(dá)盒；位于表達(dá)盒5'端的由反向終止密碼子組成的短的序列延伸和位于表達(dá)盒3'端的由正向終止密碼子組成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的靶序列，所述靶序列含有可被所述序列特異性核酸酶切割的靶位點(diǎn)；位于兩端的保護(hù)序列；其中所述表達(dá)盒包含由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記物基因；

優(yōu)選，所述序列特異性核酸酶是鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)、Cas9核酸酶、或NgAgo核酸酶；

優(yōu)選，所述線性供體DNA僅在5'端或3'端具有靶序列，或所述線性供體DNA在兩端分別具有靶序列；進(jìn)一步優(yōu)選，所述線性供體DNA中兩端的靶序列不同；更進(jìn)一步優(yōu)選，所述線性供體DNA中兩端的不同靶序列來自于相同的基因，或所述線性供體DNA中兩端的不同靶序列來自于不同的基因；

優(yōu)選，所述標(biāo)記物基因是抗生素抗性基因或熒光蛋白基因。

2.在細(xì)胞中產(chǎn)生基因敲除的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)向細(xì)胞中引入能切割細(xì)胞基因組中特定靶位點(diǎn)的序列特異性核酸酶和供體構(gòu)建體；

其中所述供體構(gòu)建體是線性供體DNA或可在細(xì)胞中被切割產(chǎn)生線性供體DNA，所述線性供體DNA由中間向兩端依次包含：表達(dá)盒；位于表達(dá)盒5'端的由反向終止密碼子組成的短的序列延伸和位于表達(dá)盒3'端的由正向終止密碼子組成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的靶序列，所述靶序列含有可被所述序列特異性核酸酶切割的靶位點(diǎn)；位于兩端的保護(hù)序列；所述表達(dá)盒包含由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記物基因；

其中線性供體DNA通過非同源末端連接被插入到細(xì)胞基因組中的特定靶位點(diǎn)；

(2)篩選所述標(biāo)記物表達(dá)陽性的細(xì)胞；

優(yōu)選，所述基因敲除是單個(gè)基因敲除或多基因敲除；

優(yōu)選，所述標(biāo)記物基因是抗生素抗性基因或熒光蛋白基因；進(jìn)一步優(yōu)選，步驟(2)中通過藥物抗性篩選細(xì)胞，或步驟(2)中通過FACS方法篩選細(xì)胞。

3.權(quán)利要求2的方法，其中所述序列特異性核酸酶是鋅指核酸酶(ZFN)，或轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)子核酸酶(TALEN)。

4.權(quán)利要求2的方法，其中所述序列特異性核酸酶是Cas9核酸酶；

優(yōu)選，步驟(1)中還包括向細(xì)胞中引入識別細(xì)胞基因組中特定靶位點(diǎn)的sgRNA，其中線性供體DNA中的靶序列包含被所述sgRNA識別的靶位點(diǎn)。

5.權(quán)利要求4的方法，其中所述sgRNA識別細(xì)胞基因組中單個(gè)特定靶位點(diǎn)，包含被所述gRNA識別的靶位點(diǎn)的靶序列位于線性供體DNA的5'端和/或3'端；

優(yōu)選，包含被所述gRNA識別的靶位點(diǎn)的靶序列來自于細(xì)胞基因組中的單個(gè)基因；或包含被所述gRNA識別的靶位點(diǎn)的靶序列是細(xì)胞基因組中兩個(gè)或多個(gè)基因的共有序列，條件是所述共有序列與所述兩個(gè)或多個(gè)基因的任何一個(gè)上與共有序列對應(yīng)位置處的序列具有不超過一個(gè)堿基的差異。

6.權(quán)利要求4的方法，其中所述sgRNA是兩個(gè)sgRNA，分別識別細(xì)胞基因組中一個(gè)基因上的兩個(gè)特定靶位點(diǎn)，分別包含被所述兩個(gè)sgRNA識別的兩個(gè)靶位點(diǎn)的兩個(gè)靶序列分別位于兩個(gè)線性供體DNA中，或者分別位于同一個(gè)線性供體DNA的兩端。

7.權(quán)利要求4的方法，其中所述sgRNA是兩個(gè)或多個(gè)sgRNA，分別包含被所述兩個(gè)或多個(gè)sgRNA識別的兩個(gè)或更多個(gè)靶位點(diǎn)的兩個(gè)或更多個(gè)靶序列分別位于同一個(gè)線性供體DNA的兩端或者位于不同的線性供體DNA中；其中所述兩個(gè)或更多個(gè)靶位點(diǎn)分別位于細(xì)胞基因組中不同的基因上。

8.權(quán)利要求2的方法，其中所述序列特異性核酸酶是NgAgo核酸酶；

優(yōu)選，步驟(1)還包括向細(xì)胞中引入識別細(xì)胞基因組中特定靶位點(diǎn)的gDNA，其中線性供體DNA中的靶序列包含被所述gDNA識別的靶位點(diǎn)。