[發(fā)明專利]一種酶法檢測羧酸酯酶2的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2016-06-14
• 公開（公告）號: CN107502652A
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊凌;葛廣波;金強(qiáng);王丹丹;于洋;杜遜甫
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44
• 代理公司: 沈陽晨創(chuàng)科技專利代理有限責(zé)任公司21001
• 代理人: 張晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種酶法檢測羧酸酯酶2的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CE)是絲氨酸水解酶家族的重要成員之一，廣泛分布于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。該酶參與多種酯類藥物、環(huán)境毒物及致癌物的解毒和代謝，能有效催化羧酸酯類、氨甲酸酯類、酰胺類、硫酯類等外源性物質(zhì)的水解。在人體中，羧酸酯酶主要包括羧酸酯酶1(CE1)和羧酸酯酶2(CE2)兩個(gè)亞型，二者具有40％-60％的氨基酸同源性，而在組織分布和底物特異性上存在顯著差異。CE2在人腸道和很多腫瘤組織中高表達(dá)，在提高很多前藥的口服生物利用度中起著十分重要作用，并且其活性也會影響很多酯類抗癌試劑(如伊立替康和卡培他汀)的療效。機(jī)體羧酸酯酶的組織分布與功能差異不僅決定其處置酯類外源物的能力，還與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，精確測量不同生物體系中CE2的真實(shí)活性在臨床上意義十分重大。

截至目前，CE2的定量方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、免疫印跡法(Western Blotting)、質(zhì)譜法和熒光檢測法等。熒光法由于快速、靈敏精度高等優(yōu)點(diǎn)而廣受歡迎，但是市面上已有的熒光檢測方法所使用的底物都存在發(fā)射波長短(λ_em＜650nm)的缺點(diǎn)，受生物基質(zhì)自身熒光的干擾較大。而近紅外熒光探針發(fā)射波長處于近紅外(λ_em＞650nm)，可排除背景熒光干擾，靈敏度高，因而開發(fā)基于近紅外熒光探針的羧酸酯酶2的熒光檢測方法具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速簡便的酶法檢測羧酸酯酶2的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種CE2活性檢測的試劑盒及其使用方法與應(yīng)用。該試劑盒使用1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(DDAB)作為CE2的探針底物，經(jīng)CE2水解后可生成具有良好光學(xué)屬性的水解產(chǎn)物。基于單位時(shí)間產(chǎn)物的生成量來表示酶的活性。該酶促反應(yīng)具有選擇性高、代謝產(chǎn)物易檢測、酶活及抑制活性評價(jià)快速高效等特點(diǎn)。

一種檢測羧酸酯酶2的試劑盒，該試劑盒包括四種試劑，分別為試劑I、試劑II、試劑III和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品；

所述試劑I為：pH＝7.4,100mM磷酸鹽緩沖液，

所述試劑II為0.1～10mM的探針底物1,3-二氯-7-羥基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮的苯甲酰酯(DDAB)溶液，溶劑為甲醇、乙腈、二甲基亞砜中任意一種，

所述試劑III為反應(yīng)終止劑，可選色譜純乙腈或色譜純甲醇，

所述質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品為5mg/ml的CE2水溶液。

一種酶法檢測羧酸酯酶2的試劑盒的使用方法，具體按下面步驟進(jìn)行：

(1)預(yù)孵育：在總體積為V₀的反應(yīng)體系中，將待測樣品與試劑I混勻，20～60℃下孵育3～5分鐘,待測樣品終濃度為0-10μg/mL；

(2)起始反應(yīng)：加入試劑II混勻，試劑II的終濃度5μM，20～60℃下孵育5-20分鐘；

(3)終止反應(yīng)：加入體積數(shù)為V₀的試劑III，劇烈震蕩10秒；

(4)檢測：離心后取上清于酶標(biāo)儀或全自動(dòng)生化儀檢測熒光值，檢測條件為：激發(fā)波長600nm，發(fā)射波長662nm；或測646nm處的吸光值。

(5)回算：取熒光值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算樣品中羧酸酯酶2含量。

所述待測樣品為：重組表達(dá)人源或動(dòng)物的羧酸酯酶2單酶、含有羧酸酯酶2的細(xì)胞或組織制備液、動(dòng)物活組織切片、含有羧酸酯酶2的各類細(xì)胞等生物體系；

一種酶法檢測羧酸酯酶2的試劑盒的應(yīng)用，該試劑盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量檢測，以及該酶抑制劑的快速篩選與評估。

所述試劑盒用于羧酸酯酶2活性的快速定量檢測的方法為：探針底物DDAB可被羧酸酯酶特異性水解為與發(fā)射波長處于近紅外的熒光產(chǎn)物DDAO；按照試劑盒的使用方法，通過定量檢測單位時(shí)間內(nèi)底物的消除量以及水解產(chǎn)物的生成量來測定不同樣本中羧酸酯酶2的活性。

該試劑盒用于羧酸酯酶2抑制劑的快速篩選與評估方法為：以探針底物DDAB水解反應(yīng)作為CE2的特異性探針反應(yīng)，按照試劑盒的使用方法，通過定量比較抑制劑存在與缺失狀態(tài)下單位時(shí)間內(nèi)水解產(chǎn)物的生成量評估該生物體系中CE2的殘余活性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價(jià)。