[發明專利]骨肉瘤循環腫瘤細胞鑒定試劑盒

在審

• 申請號: 201610407678.0
• 申請日: 2016-06-08
• 公開（公告）號: CN107475356A
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發明（設計）人: 劉蘇燕;吳詩揚;董艷
• 申請（專利權）人: 益善生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 萬志香

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學和生物技術，具體的是涉及一種骨肉瘤循環腫瘤細胞鑒定試劑盒。

背景技術

骨肉瘤(osteosarcoma)也叫成骨肉瘤，是較常見的發生在20歲以下的青少年或兒童的一種惡性骨腫瘤，約占青少年原發性惡性骨腫瘤的60％。骨肉瘤是由間質細胞系發展而來，其惡性程度高，生長速度快，伴隨著高頻率的遠處轉移，腫瘤的迅速生長是由于腫瘤經軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織。目前骨肉瘤仍是兒童和青少年惡性腫瘤死亡率很高的疾病，其惡性程度甚高，預后極差，可于數月內出現肺部轉移，截肢后3～5年存活率僅為5～20％，但早期發現和及時治療可在很大程度上提高該病的生存率。

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是因自發或診療操作從實體腫瘤病灶(原發灶、轉移灶)脫落，進入外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，目前認為CTCs可能是腫瘤轉移的早期階段。腫瘤細胞在進入外周血循環的過程中可能發生上皮-間質轉變(ETM，Epithelial-mesenchymal Transition)，EMT過程中，除了細胞形態和移動性發生改變外，細胞基因表達譜特別是上皮、間質分子標志物及其轉錄因子的表達也發生改變，發生EMT的腫瘤細胞間黏附改變，遷移和侵襲能力增強。根據CTCs抗原標志物的差異，目前CTCs主要可分為上皮標志物陽性表型(簡稱上皮細胞型)、間質標志物陽性表型(簡稱間質細胞型)和上皮與間質混合表型(簡稱上皮-間質細胞型)等，不同類型CTCs具有不同的遷移和侵襲能力。因此，對骨肉瘤患者循環腫瘤細胞進行鑒定和分型對骨肉瘤的早期診斷、治療指導以及預后等具有重要意義。

目前對癌癥患者CTCs的鑒定和分型主要依賴于皮細胞標志物和間質細胞標志物的檢測，常用的上皮細胞標志物主要包括上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、角蛋白(keratin,KRT)和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等，間質細胞標志物主要包括N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纖連蛋白(fibronectin)以及EMT相關轉錄因子AKT2、ZEB1、ZEB2和SNAIL等。根據上皮細胞標志物和間質細胞標志物的表達情況對患者CTCs進行分型，從分型結果可直接評估CTCs的轉移能力。但與其他癌癥類型不同，骨肉瘤是由間質細胞系發展而來的惡性腫瘤，本身就表達某些間質細胞標志物。因此，不能使用與其他癌癥類型相同的間質細胞標志物對骨肉瘤患者CTCs進行分型和轉移能力評估。目前，國內外均沒有穩定的適應于骨肉瘤患者CTCs分型和轉移能力評估的產品。因此，急需篩選出能對骨肉瘤患者CTCs轉移能力進行特異性評估的骨肉瘤轉移相關間質細胞標志物，并提供一種實現骨肉瘤患者CTCs的精確鑒定、分型和轉移能力評估的檢測方法。

我們前期提出的申請號為201510919145.6的專利申請，由于技術方案中篩選得到的標志物相對較少，在一定程度上影響了檢測的靈敏度和特異性。需要對技術改進，提高其檢測的靈敏度和特異性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、準確度高的骨肉瘤循環腫瘤細胞鑒定試劑盒。

實現上述目的的技術方案如下。

一種骨肉瘤循環腫瘤細胞鑒定試劑盒，包括針對每種標志基因mRNA的捕獲探針和信號放大系統，所述標志基因mRNA包括有如下兩類：選自EpCAM、CDH1、KRT8、KRT16、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20中的至少兩種的上皮細胞標志基因，選自MMP2、MMP9、VIM、CDH2、FN1、HIF-1a、SERPINE1、SURVIVIN、TWIST1、AKT2、SNAIL中的至少兩種的骨肉瘤轉移相關間質細胞標志基因；所述信號放大系統包括有末端修飾有熒光基團的擴增探針，或包括有擴增探針和末端修飾有熒光基團的標記探針，不同種類目標基因的熒光基團互不相同；其中，